از بازدید شما از Nature.com متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می‌کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین تجربه، توصیه می‌کنیم از یک مرورگر به‌روز استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). در عین حال، برای اطمینان از ادامه پشتیبانی، سایت را بدون استایل‌ها و جاوا اسکریپت رندر خواهیم کرد.
اخیراً، یک پلتفرم ضدمیکروبی عاری از مواد شیمیایی مبتنی بر فناوری نانو با استفاده از نانوساختارهای آب مصنوعی (EWNS) توسعه داده شده است. EWNS دارای بار سطحی بالایی هستند و با گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) اشباع شده‌اند که می‌توانند با تعدادی از میکروارگانیسم‌ها، از جمله پاتوژن‌های غذایی، تعامل داشته و آنها را غیرفعال کنند. در اینجا نشان داده شده است که خواص آنها در طول سنتز می‌تواند به دقت تنظیم و بهینه شود تا پتانسیل ضدباکتریایی آنها بیشتر افزایش یابد. پلتفرم آزمایشگاهی EWNS برای تنظیم دقیق خواص EWNS با تغییر پارامترهای سنتز طراحی شده است. توصیف خواص EWNS (بار، اندازه و محتوای ROS) با استفاده از روش‌های تحلیلی مدرن. علاوه بر این، آنها از نظر پتانسیل غیرفعال‌سازی میکروبی در برابر میکروارگانیسم‌های غذایی مانند اشریشیا کلی، سالمونلا انتریکا، لیستریا اینوکوئوس، مایکوباکتریوم پاراکسیدنتوم و ساکارومایسس سرویزیه ارزیابی شدند. نتایج ارائه شده در اینجا نشان می‌دهد که خواص EWNS را می‌توان در طول سنتز تنظیم کرد و در نتیجه به طور تصاعدی راندمان غیرفعال‌سازی را افزایش داد. به طور خاص، بار سطحی چهار برابر افزایش یافت و گونه‌های فعال اکسیژن نیز افزایش یافتند. نرخ حذف میکروبی به عوامل میکروبی وابسته بود و پس از ۴۵ دقیقه قرار گرفتن در معرض دوز آئروسل ۴۰۰۰۰ #/cc EWNS، از ۱.۰ تا ۳.۸ log متغیر بود.
آلودگی میکروبی علت اصلی بیماری‌های ناشی از غذا است که در اثر مصرف عوامل بیماری‌زا یا سموم آنها ایجاد می‌شود. تنها در ایالات متحده، بیماری‌های ناشی از غذا سالانه حدود 76 میلیون بیماری، 325000 مورد بستری در بیمارستان و 5000 مورد مرگ را ایجاد می‌کند.1 علاوه بر این، وزارت کشاورزی ایالات متحده (USDA) تخمین می‌زند که افزایش مصرف محصولات تازه، عامل 48 درصد از کل بیماری‌های گزارش شده ناشی از غذا در ایالات متحده است.2 هزینه بیماری و مرگ ناشی از عوامل بیماری‌زای ناشی از غذا در ایالات متحده بسیار بالاست و توسط مراکز کنترل و پیشگیری از بیماری‌ها (CDC) بیش از 15.6 میلیارد دلار آمریکا در سال تخمین زده شده است.3
در حال حاضر، مداخلات ضدمیکروبی شیمیایی4، پرتویی5 و حرارتی6 برای اطمینان از ایمنی مواد غذایی، عمدتاً در نقاط کنترل بحرانی (CCP) محدود در امتداد زنجیره تولید (معمولاً پس از برداشت و/یا در طول بسته‌بندی) انجام می‌شوند و نه به طور مداوم. بنابراین، آنها مستعد آلودگی متقاطع هستند. 7. کنترل بهتر بیماری‌های ناشی از غذا و فساد مواد غذایی نیازمند مداخلات ضدمیکروبی است که به طور بالقوه می‌توانند در سراسر زنجیره از مزرعه تا سفره اعمال شوند و در عین حال اثرات و هزینه‌های زیست‌محیطی را کاهش دهند.
اخیراً، یک پلتفرم ضدمیکروبی مبتنی بر فناوری نانو و عاری از مواد شیمیایی توسعه داده شده است که می‌تواند باکتری‌های سطحی و هوابرد را با استفاده از نانوساختارهای مصنوعی آب (EWNS) غیرفعال کند. EWNS با استفاده از دو فرآیند موازی، الکترواسپری و یونیزاسیون آب سنتز شد (شکل 1a). مطالعات قبلی نشان داده‌اند که EWNS مجموعه‌ای منحصر به فرد از خواص فیزیکی و بیولوژیکی دارد8،9،10. EWNS به طور متوسط ​​10 الکترون در هر ساختار و اندازه متوسط ​​نانومقیاس 25 نانومتر دارد (شکل 1b، c)8،9،10. علاوه بر این، رزونانس اسپین الکترون (ESR) نشان داد که EWNS حاوی مقدار زیادی گونه‌های فعال اکسیژن (ROS)، عمدتاً رادیکال‌های هیدروکسیل (OH•) و سوپراکسید (O2-) است (شکل 1c)8. EVNS برای مدت طولانی در هوا باقی می‌ماند و می‌تواند با میکروارگانیسم‌های معلق در هوا و موجود در سطح برخورد کند، بار ROS خود را آزاد کند و باعث غیرفعال شدن میکروارگانیسم‌ها شود (شکل 1d). این مطالعات اولیه همچنین نشان داد که EWNS می‌تواند با باکتری‌های گرم منفی و گرم مثبت مختلف، از جمله مایکوباکتری‌ها، روی سطوح و در هوا تعامل داشته و آنها را غیرفعال کند. میکروسکوپ الکترونی عبوری نشان داد که این غیرفعال شدن ناشی از اختلال در غشای سلولی است. علاوه بر این، مطالعات استنشاق حاد نشان داده است که دوزهای بالای EWNS باعث آسیب یا التهاب ریه نمی‌شود.
(الف) الکترواسپری زمانی رخ می‌دهد که ولتاژ بالایی بین یک لوله مویین حاوی مایع و یک الکترود مقابل اعمال شود. (ب) اعمال فشار بالا منجر به دو پدیده مختلف می‌شود: (۱) الکترواسپری آب و (۲) تشکیل گونه‌های فعال اکسیژن (یون‌ها) به دام افتاده در EWNS. (ج) ساختار منحصر به فرد EWNS. (د) به دلیل ماهیت نانومقیاس آنها، EWNS بسیار متحرک هستند و می‌توانند با عوامل بیماری‌زای موجود در هوا تعامل داشته باشند.
توانایی پلتفرم ضدمیکروبی EWNS در غیرفعال کردن میکروارگانیسم‌های منتقله از غذا روی سطح غذای تازه نیز اخیراً نشان داده شده است. همچنین نشان داده شده است که بار سطحی EWNS در ترکیب با میدان الکتریکی می‌تواند برای دستیابی به رسانش هدفمند مورد استفاده قرار گیرد. علاوه بر این، نتایج اولیه برای گوجه‌فرنگی‌های ارگانیک پس از 90 دقیقه قرار گرفتن در معرض EWNS حدود 50000 #/cm3 دلگرم‌کننده بود و میکروارگانیسم‌های مختلف منتقله از غذا مانند E. coli و Listeria 11 مشاهده شد. علاوه بر این، آزمایش‌های اولیه ارگانولپتیک هیچ اثر حسی در مقایسه با گوجه‌فرنگی‌های کنترل نشان نداد. اگرچه این نتایج غیرفعال‌سازی اولیه برای کاربردهای ایمنی مواد غذایی حتی در دوزهای بسیار پایین EWNS یعنی 50000 #/cc دلگرم‌کننده است. ببینید، واضح است که پتانسیل غیرفعال‌سازی بالاتر برای کاهش بیشتر خطر عفونت و فساد مفیدتر خواهد بود.
در اینجا، ما تحقیقات خود را بر توسعه یک پلتفرم تولید EWNS متمرکز خواهیم کرد تا امکان تنظیم دقیق پارامترهای سنتز و بهینه‌سازی خواص فیزیکوشیمیایی EWNS را برای افزایش پتانسیل ضد باکتریایی آنها فراهم کنیم. به طور خاص، بهینه‌سازی بر افزایش بار سطحی آنها (برای بهبود رسانش هدفمند) و محتوای ROS (برای بهبود راندمان غیرفعال‌سازی) متمرکز شده است. با استفاده از روش‌های تحلیلی مدرن و استفاده از میکروارگانیسم‌های غذایی رایج مانند E.، خواص فیزیکوشیمیایی بهینه شده (اندازه، بار و محتوای ROS) را مشخص کنید.
EVNS با الکترواسپری همزمان و یونیزاسیون آب با خلوص بالا (18 MΩ cm-1) سنتز شد. نبولایزر الکتریکی 12 معمولاً برای اتمیزه کردن مایعات و سنتز ذرات پلیمری و سرامیکی 13 و الیاف 14 با اندازه کنترل شده استفاده می‌شود.
همانطور که در نشریات قبلی 8، 9، 10، 11 به تفصیل شرح داده شده است، در یک آزمایش معمول، ولتاژ بالایی بین یک لوله مویین فلزی و یک الکترود شمارنده متصل به زمین اعمال شد. در طول این فرآیند، دو پدیده مختلف رخ می‌دهد: i) الکترواسپری و ii) یونیزاسیون آب. یک میدان الکتریکی قوی بین دو الکترود باعث ایجاد بارهای منفی روی سطح آب تغلیظ شده می‌شود و در نتیجه مخروط‌های تیلور تشکیل می‌شوند. در نتیجه، قطرات آب با بار بالا تشکیل می‌شوند که مانند نظریه ریلی16 به ذرات کوچکتر تجزیه می‌شوند. در همان زمان، میدان‌های الکتریکی قوی باعث می‌شوند برخی از مولکول‌های آب شکافته شوند و الکترون‌ها را از دست بدهند (یونیزه شوند)، که منجر به تشکیل مقدار زیادی گونه‌های اکسیژن فعال (ROS)17 می‌شود. ROS18 تولید شده به طور همزمان در EWNS محصور شد (شکل 1c).
شکل 2a سیستم تولید EWNS توسعه‌یافته و مورد استفاده در سنتز EWNS در این مطالعه را نشان می‌دهد. آب تصفیه‌شده ذخیره‌شده در یک بطری دربسته از طریق یک لوله تفلونی (با قطر داخلی 2 میلی‌متر) به یک سوزن استیل ضد زنگ 30G (لوله مویین فلزی) وارد شد. جریان آب توسط فشار هوای داخل بطری، همانطور که در شکل 2b نشان داده شده است، کنترل می‌شود. سوزن روی یک کنسول تفلونی نصب شده است و می‌توان آن را به صورت دستی در فاصله مشخصی از الکترود شمارنده تنظیم کرد. الکترود شمارنده یک دیسک آلومینیومی صیقلی با سوراخی در مرکز برای نمونه‌برداری است. در زیر الکترود شمارنده یک قیف نمونه‌برداری آلومینیومی وجود دارد که از طریق یک دریچه نمونه‌برداری به بقیه تجهیزات آزمایش متصل است (شکل 2b). برای جلوگیری از تجمع بار که می‌تواند عملکرد نمونه‌گیر را مختل کند، تمام اجزای نمونه‌گیر به صورت الکتریکی به زمین متصل شده‌اند.
(الف) سامانه تولید نانوساختار آب مهندسی‌شده (EWNS). (ب) برش عرضی نمونه‌بردار و الکترواسپری، که مهم‌ترین پارامترها را نشان می‌دهد. (ج) چیدمان آزمایش برای غیرفعال‌سازی باکتری‌ها.
سیستم تولید EWNS که در بالا توضیح داده شد، قادر به تغییر پارامترهای کلیدی عملیاتی برای تسهیل تنظیم دقیق خواص EWNS است. ولتاژ اعمال شده (V)، فاصله بین سوزن و الکترود شمارنده (L) و جریان آب (φ) از طریق مویرگ را برای تنظیم دقیق ویژگی‌های EWNS تنظیم کنید. نماد مورد استفاده برای نمایش ترکیبات مختلف: [V (kV)، L (cm)]. جریان آب را تنظیم کنید تا یک مخروط تیلور پایدار از یک مجموعه خاص [V، L] بدست آید. برای اهداف این مطالعه، قطر روزنه الکترود شمارنده (D) در 0.5 اینچ (1.29 سانتی‌متر) نگه داشته شد.
با توجه به هندسه محدود و عدم تقارن، قدرت میدان الکتریکی را نمی‌توان از اصول اولیه محاسبه کرد. در عوض، از نرم‌افزار QuickField™ (Svendborg، دانمارک)19 برای محاسبه میدان الکتریکی استفاده شد. میدان الکتریکی یکنواخت نیست، بنابراین مقدار میدان الکتریکی در نوک مویرگ به عنوان مقدار مرجع برای پیکربندی‌های مختلف استفاده شد.
در طول مطالعه، چندین ترکیب ولتاژ و فاصله بین سوزن و الکترود مقابل از نظر تشکیل مخروط تیلور، پایداری مخروط تیلور، پایداری تولید EWNS و تکرارپذیری ارزیابی شدند. ترکیبات مختلف در جدول تکمیلی S1 نشان داده شده است.
خروجی سیستم تولید EWNS برای اندازه‌گیری غلظت تعداد ذرات، مستقیماً به یک دستگاه آنالیز اندازه ذرات با قابلیت تحرک اسکن (SMPS، مدل 3936، TSI، Shoreview، MN) و همچنین برای اندازه‌گیری جریان‌های آئروسل، همانطور که در نشریه قبلی ما توضیح داده شده است، به یک الکترومتر فارادی آئروسل (TSI، مدل 3068B، Shoreview، MN) متصل شد. برای اندازه‌گیری جریان‌های آئروسل، همانطور که در نشریه قبلی ما توضیح داده شده است، از هر دو دستگاه SMPS و الکترومتر آئروسل با سرعت جریان 0.5 لیتر در دقیقه (جریان کل نمونه 1 لیتر در دقیقه) نمونه‌برداری شد. غلظت تعداد ذرات و جریان آئروسل به مدت 120 ثانیه اندازه‌گیری شد. اندازه‌گیری 30 بار تکرار شد. بر اساس اندازه‌گیری‌های جریان، بار کل آئروسل محاسبه و میانگین بار EWNS برای تعداد کل ذرات EWNS انتخاب شده تخمین زده می‌شود. میانگین هزینه EWNS را می‌توان با استفاده از معادله (1) محاسبه کرد:
که در آن IEl جریان اندازه‌گیری شده، NSMPS غلظت دیجیتال اندازه‌گیری شده با SMPS و φEl دبی جریان در هر الکترومتر است.
از آنجا که رطوبت نسبی (RH) بر بار سطحی تأثیر می‌گذارد، دما و (RH) در طول آزمایش به ترتیب در دمای ۲۱ درجه سانتیگراد و ۴۵ درصد ثابت نگه داشته شدند.
میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM)، دستگاه Asylum MFP-3D (Asylum Research، سانتا باربارا، کالیفرنیا) و پروب AC260T (Olympus، توکیو، ژاپن) برای اندازه‌گیری اندازه و طول عمر EWNS استفاده شدند. فرکانس اسکن AFM، 1 هرتز، مساحت اسکن 5 میکرومتر × 5 میکرومتر و 256 خط اسکن بود. همه تصاویر با استفاده از نرم‌افزار Asylum (محدوده ماسک 100 نانومتر، آستانه 100 پیکومتر) تحت هم‌ترازی تصویر مرتبه اول قرار گرفتند.
قیف آزمایش برداشته شد و سطح میکا به مدت میانگین ۱۲۰ ثانیه در فاصله ۲ سانتی‌متری از الکترود شمارنده قرار داده شد تا از تجمع ذرات و تشکیل قطرات نامنظم روی سطح میکا جلوگیری شود. EWNS مستقیماً روی سطح میکای تازه برش خورده (تد پلا، ردینگ، کالیفرنیا) اسپری شد. تصویر سطح میکا بلافاصله پس از پاشش AFM. زاویه تماس سطح میکای اصلاح نشده تازه برش خورده نزدیک به ۰ درجه است، بنابراین EVNS روی سطح میکا به شکل گنبدی توزیع می‌شود. قطر (a) و ارتفاع (h) قطرات پخش شونده مستقیماً از توپوگرافی AFM اندازه‌گیری و برای محاسبه حجم انتشار گنبدی EWNS با استفاده از روش قبلاً تأیید شده ما استفاده شد. با فرض اینکه EWNSهای روی برد حجم یکسانی دارند، قطر معادل را می‌توان با استفاده از معادله (2) محاسبه کرد:
بر اساس روش توسعه‌یافته قبلی ما، از یک تله اسپین رزونانس الکترونی (ESR) برای تشخیص وجود واسطه‌های رادیکالی کوتاه‌عمر در EWNS استفاده شد. آئروسل‌ها از طریق یک دستگاه پاششگر Midget با قطر 650 میکرومتر (Ace Glass, Vineland, NJ) حاوی محلول 235 میلی‌مولار DEPMPO(5-(diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide) (Oxis International Inc.) حباب‌گذاری شدند. تمام اندازه‌گیری‌های ESR با استفاده از یک طیف‌سنج Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) و یک سلول صفحه تخت انجام شد. از نرم‌افزار Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) برای جمع‌آوری و تجزیه و تحلیل داده‌ها استفاده شد. تعیین ویژگی‌های ROS فقط برای مجموعه‌ای از شرایط عملیاتی [-6.5 kV، 4.0 cm2] انجام شد. غلظت‌های EWNS پس از در نظر گرفتن تلفات EWNS در ضربه‌گیر، با استفاده از SMPS اندازه‌گیری شدند.
سطوح ازن با استفاده از دستگاه 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8،9،10 پایش شدند.
برای تمام ویژگی‌های EWNS، مقدار میانگین به عنوان مقدار اندازه‌گیری و انحراف معیار به عنوان خطای اندازه‌گیری استفاده می‌شود. آزمون‌های T برای مقایسه مقادیر ویژگی‌های بهینه‌شده EWNS با مقادیر متناظر EWNS پایه انجام شد.
شکل 2c یک سیستم «کشش» رسوب الکترواستاتیکی (EPES) که قبلاً توسعه یافته و مشخصه‌یابی شده است را نشان می‌دهد که می‌تواند برای رساندن هدفمند EWNS به سطح مورد استفاده قرار گیرد. EPES از بارهای EVNS استفاده می‌کند که می‌توانند تحت تأثیر یک میدان الکتریکی قوی مستقیماً به سطح هدف «هدایت» شوند. جزئیات سیستم EPES در یک نشریه اخیر توسط Pyrgiotakis و همکارانش ارائه شده است. 11. بنابراین، EPES شامل یک محفظه PVC چاپ سه‌بعدی با انتهای مخروطی است و شامل دو صفحه فلزی موازی از جنس استیل ضد زنگ (فولاد ضد زنگ 304، روکش آینه‌ای) در مرکز با فاصله 15.24 سانتی‌متر از هم است. تخته‌ها به یک منبع ولتاژ بالای خارجی (Bertran 205B-10R، Spellman، Hauppauge، NY) متصل بودند، صفحه پایینی همیشه به ولتاژ مثبت متصل بود و صفحه بالایی همیشه به زمین (زمین شناور) متصل بود. دیواره‌های محفظه با فویل آلومینیومی پوشانده شده‌اند که برای جلوگیری از اتلاف ذرات، به صورت الکتریکی به زمین متصل شده است. این محفظه دارای یک درب بارگذاری جلویی مهر و موم شده است که به سطوح آزمایش اجازه می‌دهد تا روی پایه‌های پلاستیکی قرار گیرند که آنها را بالاتر از صفحه فلزی پایینی قرار می‌دهد تا از تداخل ولتاژ بالا جلوگیری شود.
راندمان رسوب‌گذاری EWNS در EPES طبق پروتکل توسعه‌یافته قبلی که جزئیات آن در شکل تکمیلی S111 آمده است، محاسبه شد.
به عنوان محفظه کنترل، یک محفظه جریان استوانه‌ای دوم به صورت سری به سیستم EPES متصل شد که در آن از یک فیلتر HEPA میانی برای حذف EWNS استفاده شد. همانطور که در شکل 2c نشان داده شده است، آئروسل EWNS از طریق دو محفظه داخلی پمپ شد. فیلتر بین اتاق کنترل و EPES هرگونه EWNS باقی مانده را حذف می‌کند و در نتیجه دما (T)، رطوبت نسبی (RH) و سطح ازن یکسان می‌شود.
میکروارگانیسم‌های مهم منتقله از طریق غذا، غذاهای تازه را آلوده می‌کنند، مانند E. coli (ATCC #27325)، نشانگر مدفوعی، Salmonella enterica (ATCC #53647)، پاتوژن منتقله از طریق غذا، Listeria بی‌ضرر (ATCC #33090)، جایگزین Listeria monocytogenes بیماری‌زا، مشتق شده از ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098)، جایگزینی برای مخمر فاسد، و یک باکتری غیرفعال مقاوم‌تر، Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
جعبه‌های تصادفی گوجه‌فرنگی‌های انگوری ارگانیک را از فروشگاه محلی خود خریداری کنید و تا زمان استفاده (حداکثر ۳ روز) در دمای ۴ درجه سانتیگراد در یخچال نگهداری کنید. گوجه‌فرنگی‌های آزمایشی همگی به یک اندازه و قطر حدود ۱/۲ اینچ بودند.
پروتکل‌های کشت، تلقیح، مواجهه و شمارش کلنی در نشریه قبلی ما به تفصیل شرح داده شده و در داده‌های تکمیلی نیز به تفصیل آمده است. اثربخشی EWNS با قرار دادن گوجه‌فرنگی‌های تلقیح شده در معرض ۴۰۰۰۰ #/cm3 به مدت ۴۵ دقیقه ارزیابی شد. به طور خلاصه، از سه گوجه‌فرنگی برای ارزیابی میکروارگانیسم‌های زنده در زمان t = ۰ دقیقه استفاده شد. سه گوجه‌فرنگی در EPES قرار داده شدند و در معرض ۴۰۰۰۰ #/cc در معرض EWNS قرار گرفتند (گوجه‌فرنگی‌های مواجهه یافته با EWNS) و سه گوجه‌فرنگی باقی‌مانده در محفظه کنترل (گوجه‌فرنگی‌های کنترل) قرار گرفتند. فرآوری اضافی گوجه‌فرنگی‌ها در هر دو گروه انجام نشد. گوجه‌فرنگی‌های مواجهه یافته با EWNS و گوجه‌فرنگی‌های کنترل پس از ۴۵ دقیقه برای ارزیابی اثر EWNS برداشته شدند.
هر آزمایش در سه تکرار انجام شد. تجزیه و تحلیل داده‌ها طبق پروتکل شرح داده شده در داده‌های تکمیلی انجام شد.
مکانیسم‌های غیرفعال‌سازی با رسوب‌گذاری نمونه‌های EWNS در معرض تابش (45 دقیقه در غلظت آئروسل EWNS با غلظت 40000 #/cm3) و نمونه‌های بدون تابش از باکتری‌های بی‌ضرر E. coli، Salmonella enterica و Lactobacillus ارزیابی شدند. ذرات در 2.5٪ گلوتارآلدئید، 1.25٪ پارافرمالدهید و 0.03٪ اسید پیکریک در بافر کاکودیلات سدیم 0.1 مولار (pH 7.4) به مدت 2 ساعت در دمای اتاق تثبیت شدند. پس از شستشو، به مدت 2 ساعت با 1٪ تتراکسید اسمیوم (OsO4)/1.5٪ فروسیانید پتاسیم (KFeCN6) تثبیت شدند، 3 بار در آب شسته شدند و به مدت 1 ساعت در 1٪ استات اورانیل انکوبه شدند، سپس دو بار در آب شسته شدند و سپس به مدت 10 دقیقه در الکل 50٪، 70٪، 90٪ و 100٪ آبگیری شدند. سپس نمونه‌ها به مدت ۱ ساعت در اکسید پروپیلن قرار داده شدند و با مخلوط ۱:۱ اکسید پروپیلن و TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA) آغشته شدند. نمونه‌ها در TAAB Epon قرار داده شده و به مدت ۴۸ ساعت در دمای ۶۰ درجه سانتیگراد پلیمریزه شدند. رزین دانه‌ای پخت شده برش داده شد و با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری معمولی JEOL 1200EX (JEOL، توکیو، ژاپن) مجهز به دوربین AMT 2k CCD (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, USA) توسط TEM مشاهده شد.
تمام آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شد. برای هر نقطه زمانی، محلول‌های شستشوی باکتریایی در سه تکرار کشت داده شدند که در مجموع نه نقطه داده در هر نقطه وجود داشت که میانگین آنها به عنوان غلظت باکتری برای آن میکروارگانیسم خاص استفاده شد. انحراف معیار به عنوان خطای اندازه‌گیری استفاده شد. همه نقاط حساب می‌شوند.
لگاریتم کاهش غلظت باکتری‌ها در مقایسه با t = 0 دقیقه با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد:
که در آن C0 غلظت باکتری در نمونه کنترل در زمان 0 (یعنی پس از خشک شدن سطح اما قبل از قرار دادن در محفظه) و Cn غلظت باکتری روی سطح پس از n دقیقه قرار گرفتن در معرض آن است.
برای در نظر گرفتن تخریب طبیعی باکتری‌ها در طول ۴۵ دقیقه قرار گرفتن در معرض نور، کاهش لگاریتمی در مقایسه با نمونه کنترل پس از ۴۵ دقیقه نیز به شرح زیر محاسبه شد:
که در آن Cn غلظت باکتری در نمونه کنترل در زمان n و Cn-Control غلظت باکتری‌های کنترل در زمان n است. داده‌ها به صورت لگاریتمی کاهش در مقایسه با کنترل (بدون مواجهه با EWNS) ارائه شده‌اند.
در طول مطالعه، چندین ترکیب ولتاژ و فاصله بین سوزن و الکترود شمارنده از نظر تشکیل مخروط تیلور، پایداری مخروط تیلور، پایداری تولید EWNS و تکرارپذیری ارزیابی شدند. ترکیبات مختلف در جدول تکمیلی S1 نشان داده شده‌اند. دو مورد که خواص پایدار و تکرارپذیر (مخروط تیلور، تولید EWNS و پایداری در طول زمان) را نشان می‌دهند، برای مطالعه جامع انتخاب شدند. در شکل 3 نتایج مربوط به بار، اندازه و محتوای ROS در هر دو مورد نشان داده شده است. نتایج همچنین در جدول 1 خلاصه شده‌اند. برای مرجع، هم شکل 3 و هم جدول 1 شامل خواص EWNS8، 9، 10، 11 سنتز شده قبلی (پایه-EWNS) هستند. محاسبات معناداری آماری با استفاده از آزمون t دو طرفه در جدول تکمیلی S2 بازنشر شده است. علاوه بر این، داده‌های اضافی شامل مطالعاتی در مورد تأثیر قطر سوراخ نمونه‌برداری الکترود شمارنده (D) و فاصله بین الکترود زمین و نوک (L) است (شکل‌های تکمیلی S2 و S3).
(ac) توزیع اندازه اندازه‌گیری شده توسط AFM. (df) مشخصه بار سطحی. (g) توصیف ROS از EPR.
همچنین لازم به ذکر است که برای همه شرایط فوق، جریان یونیزاسیون اندازه‌گیری شده بین ۲ تا ۶ میکروآمپر و ولتاژ بین -۳.۸ تا -۶.۵ کیلوولت بود که منجر به مصرف برق کمتر از ۵۰ میلی‌وات برای این ماژول تماسی نسل EWNS شد. اگرچه EWNS تحت فشار بالا سنتز شد، اما سطح ازن بسیار پایین بود و هرگز از ۶۰ ppb تجاوز نکرد.
شکل تکمیلی S4 میدان‌های الکتریکی شبیه‌سازی شده را به ترتیب برای سناریوهای [-6.5 کیلوولت، 4.0 سانتی‌متر] و [-3.8 کیلوولت، 0.5 سانتی‌متر] نشان می‌دهد. برای سناریوهای [-6.5 کیلوولت، 4.0 سانتی‌متر] و [-3.8 کیلوولت، 0.5 سانتی‌متر]، محاسبات میدان به ترتیب 2 × 105 ولت بر متر و 4.7 × 105 ولت بر متر است. این قابل انتظار است، زیرا در حالت دوم نسبت ولتاژ-فاصله بسیار بیشتر است.
شکل‌های 3a و 3b قطر EWNS اندازه‌گیری شده با AFM8 را نشان می‌دهند. میانگین قطرهای EWNS محاسبه شده به ترتیب برای طرح‌های [-6.5 کیلوولت، 4.0 سانتی‌متر] و [-3.8 کیلوولت، 0.5 سانتی‌متر] 27 نانومتر و 19 نانومتر بودند. برای سناریوهای [-6.5 کیلوولت، 4.0 سانتی‌متر] و [-3.8 کیلوولت، 0.5 سانتی‌متر]، انحراف معیار هندسی توزیع‌ها به ترتیب 1.41 و 1.45 است که نشان‌دهنده توزیع اندازه باریک است. هم اندازه میانگین و هم انحراف معیار هندسی به ترتیب 25 نانومتر و 1.41 به EWNS پایه بسیار نزدیک هستند. شکل 3c توزیع اندازه EWNS پایه اندازه‌گیری شده با استفاده از همان روش تحت شرایط یکسان را نشان می‌دهد.
در شکل 3d، e نتایج مشخصه‌یابی بار را نشان می‌دهد. داده‌ها، میانگین اندازه‌گیری‌های 30 اندازه‌گیری همزمان غلظت (تعداد در هر سانتی‌متر مکعب) و جریان (I) هستند. تجزیه و تحلیل نشان می‌دهد که میانگین بار روی EWNS به ترتیب برای [-6.5 کیلوولت، 4.0 سانتی‌متر] و [-3.8 کیلوولت، 0.5 سانتی‌متر]، 22 ± 6 e- و 44 ± 6 e- است. آن‌ها در مقایسه با EWNS پایه (10 ± 2 e-)، دو برابر بیشتر از سناریوی [-6.5 کیلوولت، 4.0 سانتی‌متر] و چهار برابر بیشتر از [-3.8 کیلوولت، 0.5 سانتی‌متر]، بارهای سطحی به طور قابل توجهی بالاتری دارند. شکل 3f داده‌های بار را برای Baseline-EWNS نشان می‌دهد.
از نقشه‌های غلظت عدد EWNS (شکل‌های تکمیلی S5 و S6)، می‌توان دریافت که سناریوی [-6.5 کیلوولت، 4.0 سانتی‌متر] ذرات به طور قابل توجهی بیشتری نسبت به سناریوی [-3.8 کیلوولت، 0.5 سانتی‌متر] دارد. همچنین شایان ذکر است که غلظت عدد EWNS تا 4 ساعت (شکل‌های تکمیلی S5 و S6) پایش شد، که در آن پایداری تولید EWNS سطوح یکسانی از غلظت عدد ذرات را در هر دو مورد نشان داد.
شکل 3g طیف EPR را پس از تفریق کنترل بهینه‌شده EWNS (زمینه) در [-6.5 کیلوولت، 4.0 سانتی‌متر] نشان می‌دهد. طیف‌های ROS همچنین با سناریوی Baseline-EWNS در یک کار منتشر شده قبلی مقایسه شدند. تعداد EWNSهایی که با تله‌های اسپینی واکنش می‌دهند، 7.5 × 104 EWNS/s محاسبه شد که مشابه Baseline-EWNS8 منتشر شده قبلی است. طیف‌های EPR به وضوح وجود دو نوع ROS را نشان دادند، که O2- گونه غالب و OH• فراوانی کمتری داشت. علاوه بر این، مقایسه مستقیم شدت پیک‌ها نشان داد که EWNS بهینه شده در مقایسه با EWNS پایه، محتوای ROS به طور قابل توجهی بالاتری دارد.
شکل ۴ راندمان رسوب‌گذاری EWNS در EPES را نشان می‌دهد. داده‌ها همچنین در جدول ۱ خلاصه شده و با داده‌های اصلی EWNS مقایسه شده‌اند. برای هر دو مورد EUNS، رسوب‌گذاری حتی در ولتاژ پایین ۳.۰ کیلوولت نزدیک به ۱۰۰٪ است. معمولاً ۳.۰ کیلوولت برای رسوب‌گذاری ۱۰۰٪، صرف نظر از تغییر بار سطحی، کافی است. در شرایط یکسان، راندمان رسوب‌گذاری Baseline-EWNS به دلیل بار کمتر آنها (به طور متوسط ​​۱۰ الکترون در هر EWNS) تنها ۵۶٪ بود.
در شکل ۵ و جدول ۲، مقدار غیرفعال‌سازی میکروارگانیسم‌های تلقیح‌شده روی سطح گوجه‌فرنگی پس از قرار گرفتن در معرض حدود ۴۰۰۰۰ #/cm3 EWNS به مدت ۴۵ دقیقه در حالت بهینه [-۶.۵ کیلوولت، ۴.۰ سانتی‌متر] خلاصه شده است. اشریشیا کلی و لاکتوباسیلوس اینوکوئوس تلقیح‌شده، کاهش قابل توجهی معادل ۳.۸ لگاریتم در طول ۴۵ دقیقه قرار گرفتن در معرض این ماده نشان دادند. در شرایط مشابه، S. enterica کاهش ۲.۲ لگاریتمی داشت، در حالی که S. cerevisiae و M. parafortutum کاهش ۱.۰ لگاریتمی داشتند.
تصاویر میکروسکوپ الکترونی (شکل 6) تغییرات فیزیکی ناشی از EWNS را بر روی سلول‌های بی‌ضرر اشریشیا کلی، استرپتوکوک و لاکتوباسیلوس که منجر به غیرفعال شدن آنها می‌شود، نشان می‌دهند. باکتری‌های گروه کنترل دارای غشای سلولی سالم بودند، در حالی که باکتری‌های در معرض قرار گرفته دارای غشای خارجی آسیب دیده بودند.
تصویربرداری میکروسکوپ الکترونی از باکتری‌های گروه کنترل و باکتری‌های در معرض نور، آسیب غشایی را نشان داد.
داده‌های مربوط به خواص فیزیکوشیمیایی EWNS بهینه‌شده به‌طور کلی نشان می‌دهد که خواص (بار سطحی و محتوای ROS) EWNS در مقایسه با داده‌های پایه EWNS که قبلاً منتشر شده بودند، به‌طور قابل‌توجهی بهبود یافته‌اند8،9،10،11. از سوی دیگر، اندازه آنها در محدوده نانومتر باقی مانده است، بسیار شبیه به نتایج گزارش‌شده قبلی، که به آنها اجازه می‌دهد برای مدت طولانی در هوا باقی بمانند. پراکندگی مشاهده‌شده را می‌توان با تغییرات بار سطحی که اندازه EWNS را تعیین می‌کنند، تصادفی بودن اثر ریلی و پتانسیل انعقاد توضیح داد. با این حال، همانطور که توسط نیلسن و همکارانش شرح داده شده است. 22، بار سطحی بالا با افزایش مؤثر انرژی/کشش سطحی قطره آب، تبخیر را کاهش می‌دهد. در انتشار قبلی ما8، این نظریه برای ریزقطرات 22 و EWNS به صورت تجربی تأیید شد. از دست دادن بار در طول زمان نیز می‌تواند بر اندازه تأثیر بگذارد و در توزیع اندازه مشاهده‌شده نقش داشته باشد.
علاوه بر این، بار در هر ساختار حدود 22-44 الکترون- است که بسته به شرایط، به طور قابل توجهی بالاتر از EWNS پایه است که دارای بار متوسط ​​10 ± 2 الکترون در هر ساختار است. با این حال، باید توجه داشت که این بار متوسط ​​EWNS است. ستو و همکارانش نشان داده‌اند که بار ناهمگن است و از توزیع لگاریتمی نرمال پیروی می‌کند21. در مقایسه با کار قبلی ما، دو برابر کردن بار سطحی، راندمان رسوب در سیستم EPES را دو برابر می‌کند و تقریباً به 100٪ می‌رساند11.