Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, zullen we de site in de tussentijd zonder stijlen en JavaScript weergeven.
Onlangs is een chemievrij antimicrobieel platform ontwikkeld op basis van nanotechnologie met behulp van kunstmatige waternanostructuren (EWNS). EWNS hebben een hoge oppervlakte lading en zijn verzadigd met reactieve zuurstofsoorten (ROS) die kunnen interageren met en een aantal micro-organismen, waaronder voedseloverdragende pathogenen, kunnen inactiveren. Hier wordt aangetoond dat hun eigenschappen tijdens de synthese nauwkeurig kunnen worden afgestemd en geoptimaliseerd om hun antibacteriële potentieel verder te versterken. Het EWNS-laboratoriumplatform is ontworpen om de eigenschappen van EWNS nauwkeurig af te stemmen door de syntheseparameters te wijzigen. Karakterisering van de eigenschappen van EWNS (lading, grootte en ROS-gehalte) met behulp van moderne analytische methoden. Daarnaast werden ze geëvalueerd op hun potentieel voor microbiële inactivatie tegen voedseloverdragende micro-organismen zoals Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum en Saccharomyces cerevisiae. De hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat de eigenschappen van EWNS tijdens de synthese nauwkeurig kunnen worden afgestemd, wat resulteert in een exponentiële toename van de inactivatie-efficiëntie. In het bijzonder nam de oppervlakte lading met een factor vier toe en de hoeveelheid reactieve zuurstofsoorten steeg. De microbiële verwijderingssnelheid was afhankelijk van de microbiële samenstelling en varieerde van 1,0 tot 3,8 log na een blootstelling van 45 minuten aan een aerosol dosis van 40.000 #/cc EWNS.
Microbiële besmetting is de belangrijkste oorzaak van door voedsel overgedragen ziekten, veroorzaakt door de inname van pathogenen of hun toxines. Alleen al in de Verenigde Staten leiden door voedsel overgedragen ziekten jaarlijks tot ongeveer 76 miljoen ziektegevallen, 325.000 ziekenhuisopnames en 5.000 sterfgevallen¹. Daarnaast schat het Amerikaanse ministerie van Landbouw (USDA) dat de toegenomen consumptie van verse producten verantwoordelijk is voor 48% van alle gemelde gevallen van door voedsel overgedragen ziekten in de Verenigde Staten². De kosten van ziekte en overlijden als gevolg van door voedsel overgedragen pathogenen in de Verenigde Staten zijn zeer hoog; de Centers for Disease Control and Prevention (CDC) schatten deze op meer dan 15,6 miljard dollar per jaar³.
Momenteel worden antimicrobiële interventies met chemische4, straling5 en thermische6 middelen om de voedselveiligheid te waarborgen, meestal uitgevoerd op beperkte kritische controlepunten (CCP's) in de productieketen (meestal na de oogst en/of tijdens het verpakken) in plaats van continu. Daardoor zijn ze gevoelig voor kruisbesmetting. 7. Een betere beheersing van door voedsel overgedragen ziekten en bederf vereist antimicrobiële interventies die potentieel over de gehele keten van boer tot tafel kunnen worden toegepast, terwijl de milieubelasting en de kosten worden verlaagd.
Onlangs is een chemicaliënvrij, op nanotechnologie gebaseerd antimicrobieel platform ontwikkeld dat bacteriën op oppervlakken en in de lucht kan inactiveren met behulp van kunstmatige waternanostructuren (EWNS). EWNS werd gesynthetiseerd met behulp van twee parallelle processen: elektrospray en waterionisatie (Fig. 1a). Eerdere studies hebben aangetoond dat EWNS een unieke set fysische en biologische eigenschappen bezitten8,9,10. EWNS hebben gemiddeld 10 elektronen per structuur en een gemiddelde nanogrootte van 25 nm (Fig. 1b,c)8,9,10. Bovendien toonde elektronenspinresonantie (ESR) aan dat EWNS een grote hoeveelheid reactieve zuurstofsoorten (ROS) bevat, voornamelijk hydroxylradicalen (OH•) en superoxideradicalen (O2-) (Fig. 1c)8. EWNS blijft lange tijd in de lucht en kan botsen met micro-organismen die in de lucht zweven en op oppervlakken aanwezig zijn, waardoor ze hun ROS-lading afgeven en de micro-organismen inactiveren (Fig. 1d). Uit deze eerste onderzoeken bleek ook dat EWNS kan interageren met en verschillende gramnegatieve en grampositieve bacteriën, waaronder mycobacteriën, op oppervlakken en in de lucht kan inactiveren. Transmissie-elektronenmicroscopie toonde aan dat de inactivatie werd veroorzaakt door verstoring van het celmembraan. Bovendien hebben acute inhalatiestudies aangetoond dat hoge doses EWNS geen longschade of ontsteking veroorzaken 8.
(a) Elektrospray vindt plaats wanneer een hoge spanning wordt aangelegd tussen een capillairbuisje met vloeistof en een tegenelektrode. (b) Het aanleggen van hoge druk resulteert in twee verschillende verschijnselen: (i) elektrosprayen van water en (ii) de vorming van reactieve zuurstofsoorten (ionen) die in de EWNS worden opgesloten. (c) De unieke structuur van EWNS. (d) Door hun nanogrootte zijn EWNS zeer mobiel en kunnen ze interageren met ziekteverwekkers in de lucht.
Recent is ook aangetoond dat het EWNS-antimicrobiële platform in staat is om voedseloverdragende micro-organismen op het oppervlak van verse voedingsmiddelen te inactiveren. Het is tevens gebleken dat de oppervlakte lading van EWNS in combinatie met een elektrisch veld kan worden gebruikt voor gerichte toediening. Bovendien waren de eerste resultaten voor biologische tomaten na een blootstelling van 90 minuten aan een EWNS van ongeveer 50.000 µg/cm³ veelbelovend, waarbij verschillende voedseloverdragende micro-organismen zoals E. coli en Listeria 11 werden waargenomen. Daarnaast lieten voorlopige organoleptische tests geen sensorische effecten zien in vergelijking met controletomaten. Hoewel deze eerste inactivatieresultaten veelbelovend zijn voor toepassingen op het gebied van voedselveiligheid, zelfs bij zeer lage EWNS-doseringen van 50.000 µg/cm³, is het duidelijk dat een hoger inactivatiepotentieel gunstiger zou zijn om het risico op infectie en bederf verder te verminderen.
In dit onderzoek richten we ons op de ontwikkeling van een platform voor de generatie van EWNS (extracellulaire wateroplosbare nanodeeltjes) om de syntheseparameters nauwkeurig af te stemmen en de fysisch-chemische eigenschappen van EWNS te optimaliseren, teneinde hun antibacteriële potentieel te versterken. De optimalisatie is met name gericht op het verhogen van hun oppervlakte lading (voor een betere gerichte afgifte) en ROS-gehalte (voor een betere inactivatie-efficiëntie). We karakteriseren de geoptimaliseerde fysisch-chemische eigenschappen (grootte, lading en ROS-gehalte) met behulp van moderne analytische methoden en gebruiken daarbij gangbare micro-organismen uit voedsel, zoals E. coli.
EVNS werd gesynthetiseerd door gelijktijdige elektrospray en ionisatie van zeer zuiver water (18 MΩ cm–1). De elektrische vernevelaar 12 wordt doorgaans gebruikt voor de verneveling van vloeistoffen en de synthese van polymeer- en keramische deeltjes 13 en vezels 14 met een gecontroleerde grootte.
Zoals gedetailleerd beschreven in eerdere publicaties 8, 9, 10, 11, werd in een typisch experiment een hoge spanning aangelegd tussen een metalen capillair en een geaarde tegenelektrode. Tijdens dit proces treden twee verschillende verschijnselen op: i) elektrospray en ii) waterionisatie. Een sterk elektrisch veld tussen de twee elektroden zorgt ervoor dat negatieve ladingen zich ophopen op het oppervlak van het gecondenseerde water, wat resulteert in de vorming van Taylor-kegels. Hierdoor ontstaan ​​sterk geladen waterdruppels, die zich verder opsplitsen in kleinere deeltjes, zoals in de Rayleigh-theorie16. Tegelijkertijd zorgen sterke elektrische velden ervoor dat sommige watermoleculen splitsen en elektronen afstoten (ioniseren), wat leidt tot de vorming van een grote hoeveelheid reactieve zuurstofsoorten (ROS)17. De gelijktijdig gegenereerde ROS18 werd ingekapseld in EWNS (Fig. 1c).
Figuur 2a toont het EWNS-generatiesysteem dat is ontwikkeld en gebruikt voor de EWNS-synthese in dit onderzoek. Gezuiverd water, opgeslagen in een gesloten fles, werd via een Teflon-buis (2 mm binnendiameter) in een roestvrijstalen naald (30G) (metalen capillair) geleid. De waterstroom wordt geregeld door de luchtdruk in de fles, zoals weergegeven in figuur 2b. De naald is gemonteerd op een Teflon-console en kan handmatig op een bepaalde afstand van de tegenelektrode worden ingesteld. De tegenelektrode is een gepolijste aluminium schijf met een gat in het midden voor bemonstering. Onder de tegenelektrode bevindt zich een aluminium bemonsteringsrechter, die via een bemonsteringspoort is verbonden met de rest van de experimentele opstelling (figuur 2b). Om ladingopbouw te voorkomen die de werking van de bemonsteringsapparatuur zou kunnen verstoren, zijn alle componenten van de bemonsteringsapparatuur elektrisch geaard.
(a) Systeem voor het genereren van gemanipuleerde waternanostructuren (EWNS). (b) Doorsnede van de sampler en elektrospray, met de belangrijkste parameters. (c) Experimentele opstelling voor bacterie-inactivering.
Het hierboven beschreven EWNS-generatiesysteem is in staat om belangrijke operationele parameters te wijzigen, waardoor de eigenschappen van de EWNS nauwkeurig kunnen worden afgesteld. Door de toegepaste spanning (V), de afstand tussen de naald en de tegenelektrode (L) en de waterstroom (φ) door de capillaire buis aan te passen, kunnen de EWNS-karakteristieken worden verfijnd. Het symbool dat wordt gebruikt om verschillende combinaties weer te geven is: [V (kV), L (cm)]. Stel de waterstroom zo in dat een stabiele Taylor-kegel met een bepaalde [V, L]-waarde wordt verkregen. Voor dit onderzoek werd de diameter van de opening van de tegenelektrode (D) constant gehouden op 0,5 inch (1,29 cm).
Vanwege de beperkte geometrie en asymmetrie kan de elektrische veldsterkte niet vanuit de basisprincipes worden berekend. In plaats daarvan werd de QuickField™-software (Svendborg, Denemarken)19 gebruikt om het elektrische veld te berekenen. Het elektrische veld is niet uniform, dus werd de waarde van het elektrische veld aan het uiteinde van de capillair gebruikt als referentiewaarde voor verschillende configuraties.
Tijdens het onderzoek werden verschillende combinaties van spanning en afstand tussen de naald en de tegenelektrode geëvalueerd met betrekking tot de vorming van de Taylor-kegel, de stabiliteit van de Taylor-kegel, de stabiliteit van de EWNS-productie en de reproduceerbaarheid. Diverse combinaties worden weergegeven in aanvullende tabel S1.
De output van het EWNS-generatiesysteem werd rechtstreeks aangesloten op een Scanning Mobility Particle Size Analyzer (SMPS, model 3936, TSI, Shoreview, MN) voor het meten van de deeltjesaantalconcentratie, en op een Aerosol Faraday Electrometer (TSI, model 3068B, Shoreview, MN). De aerosolstroom werd gemeten zoals beschreven in onze vorige publicatie. Zowel de SMPS als de aerosol-elektrometer namen monsters met een debiet van 0,5 L/min (totale monsterstroom 1 L/min). De deeltjesaantalconcentratie en de aerosolstroom werden gedurende 120 seconden gemeten. De meting werd 30 keer herhaald. Op basis van de stroommetingen werd de totale aerosollading berekend en de gemiddelde EWNS-lading geschat voor een gegeven totaal aantal geselecteerde EWNS-deeltjes. De gemiddelde kosten van EWNS kunnen worden berekend met behulp van vergelijking (1):
waarbij IEl de gemeten stroomsterkte is, NSMPS de digitale concentratie gemeten met de SMPS, en φEl het debiet per elektrometer.
Omdat de relatieve luchtvochtigheid (RV) de oppervlakte lading beïnvloedt, werden de temperatuur en de RV tijdens het experiment constant gehouden op respectievelijk 21 °C en 45%.
Atoomkrachtmicroscopie (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) en AC260T-sonde (Olympus, Tokio, Japan) werden gebruikt om de grootte en levensduur van de EWNS te meten. De AFM-scanfrequentie was 1 Hz, het scanbereik was 5 μm × 5 μm en er werden 256 scanlijnen gebruikt. Alle beelden werden onderworpen aan een eerste-orde beelduitlijning met behulp van Asylum-software (maskerbereik 100 nm, drempelwaarde 100 pm).
De testtrechter werd verwijderd en het mica-oppervlak werd op een afstand van 2,0 cm van de tegenelektrode geplaatst voor een gemiddelde meettijd van 120 s om agglomeratie van deeltjes en de vorming van onregelmatige druppels op het mica-oppervlak te voorkomen. EWNS werd rechtstreeks op het oppervlak van vers gesneden mica gespoten (Ted Pella, Redding, CA). Afbeelding van het mica-oppervlak direct na AFM-sputteren. De contacthoek van het oppervlak van vers gesneden, ongemodificeerd mica is bijna 0°, waardoor EWNS zich in de vorm van een koepel over het mica-oppervlak verspreidt. De diameter (a) en hoogte (h) van de diffunderende druppels werden rechtstreeks gemeten aan de hand van de AFM-topografie en gebruikt om het koepelvormige diffusievolume van EWNS te berekenen met behulp van onze eerder gevalideerde methode. Ervan uitgaande dat de EWNS aan boord hetzelfde volume hebben, kan de equivalente diameter worden berekend met behulp van vergelijking (2):
Op basis van onze eerder ontwikkelde methode werd een elektronenspinresonantie (ESR) spinval gebruikt om de aanwezigheid van kortstondige radicaalintermediairen in EWNS te detecteren. Aerosolen werden door een 650 μm Midget-sproeier (Ace Glass, Vineland, NJ) geleid die een 235 mM oplossing van DEPMPO(5-(diethoxyfosforyl)-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide) (Oxis International Inc., Portland, Oregon) bevatte. Alle ESR-metingen werden uitgevoerd met een Bruker EMX-spectrometer (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, VS) en een vlakke cel. De Acquisit-software (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, VS) werd gebruikt om de gegevens te verzamelen en te analyseren. De bepaling van de kenmerken van de ROS werd alleen uitgevoerd voor een set bedrijfsomstandigheden [-6,5 kV, 4,0 cm]. EWNS-concentraties werden gemeten met behulp van de SMPS na correctie voor EWNS-verliezen in de impactor.
De ozonniveaus werden gemeten met behulp van een 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Voor alle EWNS-eigenschappen wordt de gemiddelde waarde als meetwaarde gebruikt en de standaardafwijking als meetfout. T-toetsen werden uitgevoerd om de waarden van de geoptimaliseerde EWNS-attributen te vergelijken met de overeenkomstige waarden van de basis-EWNS.
Figuur 2c toont een eerder ontwikkeld en gekarakteriseerd elektrostatisch precipitatiesysteem (EPES) dat gebruikt kan worden voor gerichte toediening van EWNS aan het oppervlak. EPES maakt gebruik van EVNS-ladingen die onder invloed van een sterk elektrisch veld direct naar het oppervlak van het doelwit kunnen worden geleid. Details van het EPES-systeem worden beschreven in een recente publicatie van Pyrgiotakis et al. 11. EPES bestaat uit een 3D-geprinte PVC-kamer met taps toelopende uiteinden en bevat twee parallelle roestvrijstalen (304 roestvrij staal, spiegelend gecoate) metalen platen in het midden, op een afstand van 15,24 cm van elkaar. De platen waren verbonden met een externe hoogspanningsbron (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY). De onderste plaat was altijd verbonden met de positieve spanning en de bovenste plaat altijd met aarde (zwevende aarding). De wanden van de kamer zijn bedekt met aluminiumfolie, die elektrisch geaard is om deeltjesverlies te voorkomen. De kamer heeft een afgesloten voordeur waardoor testoppervlakken op plastic standaards geplaatst kunnen worden. Deze standaards verhogen de oppervlakken boven de metalen bodemplaat om interferentie door hoge spanning te voorkomen.
De afzettingsefficiëntie van EWNS in EPES werd berekend volgens een eerder ontwikkeld protocol, zoals gedetailleerd beschreven in Aanvullende Figuur S111.
Als controlekamer werd een tweede cilindrische stromingskamer in serie met het EPES-systeem verbonden, waarin een tussenliggend HEPA-filter werd gebruikt om EWNS te verwijderen. Zoals weergegeven in figuur 2c, werd het EWNS-aerosol door twee ingebouwde kamers gepompt. Het filter tussen de controlekamer en EPES verwijdert alle resterende EWNS, waardoor dezelfde temperatuur (T), relatieve luchtvochtigheid (RH) en ozonconcentratie worden bereikt.
Er zijn belangrijke micro-organismen aangetroffen die voedsel in verse voedingsmiddelen kunnen besmetten, zoals E. coli (ATCC #27325), een fecale indicator, Salmonella enterica (ATCC #53647), een pathogeen dat voedsel overdraagt, Listeria harmless (ATCC #33090), een surrogaat voor de pathogene Listeria monocytogenes, afkomstig van ATCC (Manassas, VA), Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), een substituut voor bederfgist, en een resistentere geïnactiveerde bacterie, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Koop willekeurige dozen biologische cherrytomaten op de lokale markt en bewaar ze in de koelkast bij 4 °C tot gebruik (maximaal 3 dagen). De tomaten in het experiment hadden allemaal dezelfde grootte, ongeveer 1,25 cm in diameter.
De protocollen voor kweek, inoculatie, blootstelling en koloniebepaling worden gedetailleerd beschreven in onze eerdere publicatie en in de aanvullende gegevens. De effectiviteit van EWNS werd geëvalueerd door geïnoculeerde tomaten gedurende 45 minuten bloot te stellen aan 40.000 #/cm³. Kort gezegd werden drie tomaten gebruikt om de overlevende micro-organismen op tijdstip t = 0 min te evalueren. Drie tomaten werden in EPES geplaatst en blootgesteld aan EWNS met een concentratie van 40.000 #/cm³ (aan EWNS blootgestelde tomaten) en de overige drie werden in de controlekamer geplaatst (controletomaten). Er werd geen verdere verwerking van de tomaten in beide groepen uitgevoerd. De aan EWNS blootgestelde tomaten en de controletomaten werden na 45 minuten verwijderd om het effect van EWNS te evalueren.
Elk experiment werd in drievoud uitgevoerd. De data-analyse werd uitgevoerd volgens het protocol beschreven in de aanvullende gegevens.
De inactivatiemechanismen werden beoordeeld door sedimentatie van blootgestelde EWNS-monsters (45 min bij een EWNS-aerosolconcentratie van 40.000 #/cm³) en niet-bestraalde monsters van onschadelijke bacteriën E. coli, Salmonella enterica en Lactobacillus. De deeltjes werden gefixeerd in 2,5% glutaraldehyde, 1,25% paraformaldehyde en 0,03% picrinezuur in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer (pH 7,4) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Na het wassen werd nagefixeerd met 1% osmiumtetroxide (OsO₄)/1,5% kaliumferrocyanide (KFeCN₆) gedurende 2 uur, driemaal gewassen met water en geïncubeerd in 1% uranylacetaat gedurende 1 uur, vervolgens tweemaal gewassen met water en ten slotte gedehydrateerd in 50%, 70%, 90% en 100% alcohol gedurende 10 minuten. De monsters werden vervolgens gedurende 1 uur in propyleenoxide geplaatst en geïmpregneerd met een 1:1 mengsel van propyleenoxide en TAAP Epon (Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA). De monsters werden ingebed in TAAP Epon en gedurende 48 uur bij 60 °C gepolymeriseerd. De uitgeharde korrelige hars werd gesneden en gevisualiseerd met behulp van een conventionele transmissie-elektronenmicroscoop JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japan), uitgerust met een AMT 2k CCD-camera (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, VS).
Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd. Voor elk tijdstip werden bacteriële spoelingen in drievoud geënt, wat resulteerde in een totaal van negen datapunten per tijdstip. Het gemiddelde van deze negen datapunten werd gebruikt als de bacteriële concentratie voor dat specifieke micro-organisme. De standaardafwijking werd gebruikt als meetfout. Alle datapunten tellen mee.
De logaritme van de afname van de bacterieconcentratie ten opzichte van t = 0 min werd berekend met behulp van de volgende formule:
waarbij C0 de concentratie bacteriën in het controlemonster is op tijdstip 0 (d.w.z. nadat het oppervlak is opgedroogd maar voordat het in de kamer wordt geplaatst) en Cn de concentratie bacteriën op het oppervlak is na n minuten blootstelling.
Om rekening te houden met de natuurlijke afbraak van bacteriën gedurende de blootstelling van 45 minuten, werd de logaritmische reductie ten opzichte van de controle na 45 minuten als volgt berekend:
waarbij Cn de concentratie bacteriën in het controlemonster is op tijdstip n en Cn-Control de concentratie bacteriën in de controle op tijdstip n. De gegevens worden weergegeven als een logaritmische reductie ten opzichte van de controle (geen blootstelling aan EWNS).
Tijdens het onderzoek werden verschillende combinaties van spanning en afstand tussen de naald en de tegenelektrode geëvalueerd met betrekking tot de vorming van de Taylor-kegel, de stabiliteit van de Taylor-kegel, de stabiliteit van de EWNS-productie en de reproduceerbaarheid. Diverse combinaties worden weergegeven in Aanvullende Tabel S1. Twee gevallen met stabiele en reproduceerbare eigenschappen (Taylor-kegel, EWNS-generatie en stabiliteit in de tijd) werden geselecteerd voor een uitgebreide studie. Figuur 3 toont de resultaten voor de lading, grootte en het gehalte van ROS in beide gevallen. De resultaten zijn ook samengevat in Tabel 1. Ter referentie bevatten zowel Figuur 3 als Tabel 1 de eigenschappen van de eerder gesynthetiseerde, niet-geoptimaliseerde EWNS8, 9, 10, 11 (baseline-EWNS). Statistische significantieberekeningen met behulp van een tweezijdige t-test zijn opnieuw gepubliceerd in Aanvullende Tabel S2. Daarnaast omvatten aanvullende gegevens studies naar het effect van de diameter van het bemonsteringsgat van de tegenelektrode (D) en de afstand tussen de grondelektrode en de tip (L) (Aanvullende Figuren S2 en S3).
(ac) Grootteverdeling gemeten met AFM. (df) Karakteristiek van de oppervlaktelading. (g) ROS-karakterisering van de EPR.
Het is ook belangrijk op te merken dat onder alle bovengenoemde omstandigheden de gemeten ionisatiestroom tussen 2 en 6 μA lag en de spanning tussen -3,8 en -6,5 kV, wat resulteerde in een stroomverbruik van minder dan 50 mW voor deze contactmodule voor de generatie van EWNS. Hoewel EWNS onder hoge druk werd gesynthetiseerd, waren de ozonconcentraties zeer laag en overschreden ze nooit 60 ppb.
Aanvullende figuur S4 toont de gesimuleerde elektrische velden voor respectievelijk de scenario's [-6,5 kV, 4,0 cm] en [-3,8 kV, 0,5 cm]. Voor de scenario's [-6,5 kV, 4,0 cm] en [-3,8 kV, 0,5 cm] zijn de veldberekeningen respectievelijk 2 × 10⁵ V/m en 4,7 × 10⁵ V/m. Dit is te verwachten, aangezien in het tweede geval de spanning-afstandverhouding veel hoger is.
Figuur 3a en 3b tonen de EWNS-diameter gemeten met de AFM8. De berekende gemiddelde EWNS-diameters waren respectievelijk 27 nm en 19 nm voor de [-6,5 kV, 4,0 cm] en [-3,8 kV, 0,5 cm] schema's. Voor de [-6,5 kV, 4,0 cm] en [-3,8 kV, 0,5 cm] scenario's bedragen de geometrische standaarddeviaties van de verdelingen respectievelijk 1,41 en 1,45, wat wijst op een smalle grootteverdeling. Zowel de gemiddelde grootte als de geometrische standaarddeviatie liggen zeer dicht bij die van de basis-EWNS, respectievelijk 25 nm en 1,41. Figuur 3c toont de grootteverdeling van de basis-EWNS gemeten met dezelfde methode onder dezelfde omstandigheden.
Figuur 3d en 3e tonen de resultaten van de ladingskarakterisering. De gegevens zijn gemiddelde metingen van 30 gelijktijdige metingen van concentratie (#/cm³) en stroom (I). De analyse laat zien dat de gemiddelde lading op de EWNS 22 ± 6 e- en 44 ± 6 e- bedraagt ​​voor respectievelijk [-6,5 kV, 4,0 cm] en [-3,8 kV, 0,5 cm]. Deze hebben significant hogere oppervlakteladingen vergeleken met de basislijn-EWNS (10 ± 2 e-), tweemaal zo hoog als in het [-6,5 kV, 4,0 cm]-scenario en viermaal zo hoog als in het [-3,8 kV, 0,5 cm]-scenario. Figuur 3f toont de ladingsgegevens voor de basislijn-EWNS.
Uit de concentratiekaarten van het EWNS-aantal (aanvullende figuren S5 en S6) blijkt dat het scenario [-6,5 kV, 4,0 cm] aanzienlijk meer deeltjes bevat dan het scenario [-3,8 kV, 0,5 cm]. Het is ook belangrijk op te merken dat de EWNS-aantalconcentratie tot 4 uur lang werd gemonitord (aanvullende figuren S5 en S6), waarbij de stabiliteit van de EWNS-generatie in beide gevallen dezelfde deeltjesaantalconcentratie vertoonde.
Figuur 3g toont het EPR-spectrum na aftrek van de geoptimaliseerde EWNS-controle (achtergrond) bij [-6,5 kV, 4,0 cm]. De ROS-spectra werden ook vergeleken met het Baseline-EWNS-scenario in een eerder gepubliceerd werk. Het aantal EWNS dat reageert met spinvallen werd berekend op 7,5 × 10⁴ EWNS/s, wat vergelijkbaar is met de eerder gepubliceerde Baseline-EWNS⁸. De EPR-spectra toonden duidelijk de aanwezigheid van twee soorten ROS, waarbij O₂⁻ de overheersende soort was en OH• minder voorkwam. Bovendien bleek uit een directe vergelijking van de piekintensiteiten dat de geoptimaliseerde EWNS een significant hoger ROS-gehalte had in vergelijking met de baseline EWNS.
Figuur 4 toont de afzettingsefficiëntie van EWNS in EPES. De gegevens zijn ook samengevat in Tabel I en vergeleken met de oorspronkelijke EWNS-gegevens. In beide gevallen van EWNS is de afzetting bijna 100%, zelfs bij een lage spanning van 3,0 kV. Doorgaans is 3,0 kV voldoende voor een afzetting van 100%, ongeacht de verandering in oppervlaktelading. Onder dezelfde omstandigheden was de afzettingsefficiëntie van Baseline-EWNS slechts 56% vanwege hun lagere lading (gemiddeld 10 elektronen per EWNS).
Figuur 5 en tabel 2 geven een samenvatting van de inactivatiewaarde van micro-organismen die op het oppervlak van tomaten zijn geënt na blootstelling aan ongeveer 40.000 #/cm3 EWNS gedurende 45 minuten in de optimale modus [-6,5 kV, 4,0 cm]. Geïnoculeerde E. coli en Lactobacillus innocuous vertoonden een significante reductie van 3,8 log tijdens de blootstelling van 45 minuten. Onder dezelfde omstandigheden vertoonde S. enterica een afname van 2,2 log, terwijl S. cerevisiae en M. parafortutum een ​​afname van 1,0 log vertoonden.
De elektronenmicroscopische beelden (Figuur 6) tonen de fysieke veranderingen die EWNS teweegbrengt in onschadelijke Escherichia coli-, Streptococcus- en Lactobacillus-cellen, wat leidt tot hun inactivatie. De controlebacteriën hadden intacte celmembranen, terwijl de blootgestelde bacteriën beschadigde buitenmembranen hadden.
Elektronenmicroscopisch onderzoek van controlebacteriën en blootgestelde bacteriën bracht membraanschade aan het licht.
De gegevens over de fysisch-chemische eigenschappen van de geoptimaliseerde EWNS laten gezamenlijk zien dat de eigenschappen (oppervlaktelading en ROS-gehalte) van de EWNS aanzienlijk verbeterd zijn ten opzichte van de eerder gepubliceerde basisgegevens van EWNS8,9,10,11. Aan de andere kant bleef hun grootte in het nanometerbereik, zeer vergelijkbaar met de eerder gerapporteerde resultaten, waardoor ze gedurende lange tijd in de lucht kunnen blijven. De waargenomen polydispersiteit kan worden verklaard door veranderingen in de oppervlaktelading die de grootte van de EWNS bepalen, de willekeurigheid van het Rayleigh-effect en mogelijke coalescentie. Zoals gedetailleerd beschreven door Nielsen et al. 22, vermindert een hoge oppervlaktelading echter de verdamping door de oppervlakte-energie/spanning van de waterdruppel effectief te verhogen. In onze eerdere publicatie8 werd deze theorie experimenteel bevestigd voor microdruppels 22 en EWNS. Verlies van lading in de loop van de tijd kan ook de grootte beïnvloeden en bijdragen aan de waargenomen grootteverdeling.
Bovendien bedraagt ​​de lading per structuur ongeveer 22-44 e-, afhankelijk van de situatie, wat aanzienlijk hoger is dan bij de basis-EWNS, die een gemiddelde lading van 10 ± 2 elektronen per structuur heeft. Het is echter belangrijk op te merken dat dit de gemiddelde lading van EWNS is. Seto et al. hebben aangetoond dat de lading inhomogeen is en een lognormale verdeling volgt21. In vergelijking met ons eerdere werk verdubbelt het verdubbelen van de oppervlaktelading de depositie-efficiëntie in het EPES-systeem tot bijna 100%11.