Terima kasih kerana melayari Nature.com. Versi pelayar yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad. Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan pelayar yang dikemas kini (atau melumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan memaparkan laman web tanpa gaya dan JavaScript.
Baru-baru ini, platform antimikrob bebas kimia berdasarkan nanoteknologi menggunakan struktur nano air buatan (EWNS) telah dibangunkan. EWNS mempunyai cas permukaan yang tinggi dan tepu dengan spesies oksigen reaktif (ROS) yang boleh berinteraksi dengan dan menyahaktifkan beberapa mikroorganisma, termasuk patogen bawaan makanan. Di sini ditunjukkan bahawa sifatnya semasa sintesis boleh ditala halus dan dioptimumkan untuk meningkatkan lagi potensi antibakterianya. Platform makmal EWNS direka bentuk untuk menyempurnakan sifat EWNS dengan mengubah parameter sintesis. Pencirian sifat EWNS (cas, saiz dan kandungan ROS) menggunakan kaedah analisis moden. Di samping itu, ia dinilai untuk potensi penyahaktifan mikrobnya terhadap mikroorganisma bawaan makanan seperti Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum dan Saccharomyces cerevisiae. Keputusan yang dibentangkan di sini menunjukkan bahawa sifat EWNS boleh ditala halus semasa sintesis, menghasilkan peningkatan eksponen dalam kecekapan penyahaktifan. Khususnya, cas permukaan meningkat sebanyak empat kali ganda dan spesies oksigen reaktif meningkat. Kadar penyingkiran mikrob bergantung kepada mikrob dan berada dalam julat 1.0 hingga 3.8 log selepas pendedahan selama 45 minit kepada dos aerosol sebanyak 40,000 #/cc EWNS.
Pencemaran mikrob merupakan punca utama penyakit bawaan makanan yang disebabkan oleh pengambilan patogen atau toksinnya. Di Amerika Syarikat sahaja, penyakit bawaan makanan menyebabkan kira-kira 76 juta penyakit, 325,000 kemasukan ke hospital, dan 5,000 kematian setiap tahun1. Di samping itu, Jabatan Pertanian Amerika Syarikat (USDA) menganggarkan bahawa peningkatan penggunaan hasil segar bertanggungjawab untuk 48% daripada semua penyakit bawaan makanan yang dilaporkan di Amerika Syarikat2. Kos penyakit dan kematian yang disebabkan oleh patogen bawaan makanan di Amerika Syarikat adalah sangat tinggi, dianggarkan oleh Pusat Kawalan dan Pencegahan Penyakit (CDC) pada lebih daripada US$15.6 bilion setahun3.
Pada masa ini, intervensi antimikrob kimia4, radiasi5 dan terma6 untuk memastikan keselamatan makanan kebanyakannya dijalankan pada titik kawalan kritikal (CCP) yang terhad di sepanjang rantaian pengeluaran (biasanya selepas penuaian dan/atau semasa pembungkusan) dan bukannya secara berterusan. Oleh itu, ia terdedah kepada pencemaran silang. 7. Kawalan yang lebih baik terhadap penyakit bawaan makanan dan kerosakan makanan memerlukan intervensi antimikrob yang berpotensi digunakan merentasi kontinum dari ladang ke meja sambil mengurangkan impak dan kos alam sekitar.
Baru-baru ini, platform antimikrob berasaskan nanoteknologi bebas bahan kimia telah dibangunkan yang boleh menyahaktifkan bakteria permukaan dan bawaan udara menggunakan struktur nano air buatan (EWNS). EWNS disintesis menggunakan dua proses selari, penyemburan elektro dan pengionan air (Rajah 1a). Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa EWNS mempunyai set sifat fizikal dan biologi yang unik8,9,10. EWNS mempunyai purata 10 elektron setiap struktur dan saiz nano purata 25 nm (Rajah 1b,c)8,9,10. Di samping itu, resonans spin elektron (ESR) menunjukkan bahawa EWNS mengandungi sejumlah besar spesies oksigen reaktif (ROS), terutamanya radikal hidroksil (OH•) dan superoksida (O2-) (Rajah 1c)8. EVNS berada di udara untuk masa yang lama dan boleh berlanggar dengan mikroorganisma yang terampai di udara dan terdapat di permukaan, menghantar muatan ROS mereka dan menyebabkan penyahaktifan mikroorganisma (Rajah 1d). Kajian awal ini juga menunjukkan bahawa EWNS boleh berinteraksi dengan dan menyahaktifkan pelbagai bakteria gram-negatif dan gram-positif, termasuk mikobakteria, pada permukaan dan di udara. Mikroskopi elektron penghantaran menunjukkan bahawa penyahaktifan itu disebabkan oleh gangguan membran sel. Di samping itu, kajian penyedutan akut telah menunjukkan bahawa dos EWNS yang tinggi tidak menyebabkan kerosakan atau keradangan paru-paru 8.
(a) Semburan elektro berlaku apabila voltan tinggi dikenakan di antara tiub kapilari yang mengandungi cecair dan elektrod balas. (b) Penggunaan tekanan tinggi menghasilkan dua fenomena berbeza: (i) penyemburan elektro air dan (ii) pembentukan spesies oksigen reaktif (ion) yang terperangkap dalam EWNS. (c) Struktur unik EWNS. (d) Disebabkan sifat nanonya, EWNS sangat mudah alih dan boleh berinteraksi dengan patogen bawaan udara.
Keupayaan platform antimikrob EWNS untuk menyahaktifkan mikroorganisma bawaan makanan pada permukaan makanan segar juga baru-baru ini telah ditunjukkan. Ia juga telah ditunjukkan bahawa cas permukaan EWNS dalam kombinasi dengan medan elektrik boleh digunakan untuk mencapai penghantaran yang disasarkan. Selain itu, keputusan awal untuk tomato organik selepas pendedahan 90 minit pada EWNS kira-kira 50,000 #/cm3 adalah menggalakkan, dengan pelbagai mikroorganisma bawaan makanan seperti E. coli dan Listeria 11 diperhatikan. Di samping itu, ujian organoleptik awal tidak menunjukkan kesan deria berbanding tomato kawalan. Walaupun keputusan penyahaktifan awal ini menggalakkan untuk aplikasi keselamatan makanan walaupun pada dos EWNS yang sangat rendah iaitu 50,000#/cc. lihat, adalah jelas bahawa potensi penyahaktifan yang lebih tinggi akan lebih bermanfaat untuk mengurangkan lagi risiko jangkitan dan kerosakan.
Di sini, kami akan memfokuskan penyelidikan kami pada pembangunan platform penjanaan EWNS untuk membolehkan penalaan halus parameter sintesis dan pengoptimuman sifat fizikokimia EWNS untuk meningkatkan potensi antibakterianya. Khususnya, pengoptimuman telah memberi tumpuan kepada peningkatan cas permukaannya (untuk meningkatkan penghantaran yang disasarkan) dan kandungan ROS (untuk meningkatkan kecekapan penyahaktifan). Mencirikan sifat fizikokimia yang dioptimumkan (saiz, cas dan kandungan ROS) menggunakan kaedah analisis moden dan menggunakan mikroorganisma makanan biasa seperti E.
EVNS disintesis melalui penyemburan elektro dan pengionan air ketulenan tinggi (18 MΩ cm–1) secara serentak. Penebulizer elektrik 12 biasanya digunakan untuk pengabusan cecair dan sintesis zarah polimer dan seramik 13 dan gentian 14 yang bersaiz terkawal.
Seperti yang diperincikan dalam penerbitan terdahulu 8, 9, 10, 11, dalam eksperimen biasa, voltan tinggi telah dikenakan antara kapilari logam dan elektrod balas yang dibumikan. Semasa proses ini, dua fenomena berbeza berlaku: i) penyemburan elektro dan ii) pengionan air. Medan elektrik yang kuat antara kedua-dua elektrod menyebabkan cas negatif terkumpul di permukaan air yang terkondensasi, mengakibatkan pembentukan kon Taylor. Akibatnya, titisan air yang bercas tinggi terbentuk, yang terus pecah menjadi zarah yang lebih kecil, seperti dalam teori Rayleigh16. Pada masa yang sama, medan elektrik yang kuat menyebabkan beberapa molekul air berpecah dan menanggalkan elektron (mengion), yang membawa kepada pembentukan sejumlah besar spesies oksigen reaktif (ROS)17. ROS18 yang dihasilkan secara serentak telah dikapsulkan dalam EWNS (Rajah 1c).
Pada rajah 2a, sistem penjanaan EWNS yang dibangunkan dan digunakan dalam sintesis EWNS dalam kajian ini menunjukkan. Air yang telah ditulenkan yang disimpan dalam botol tertutup telah dimasukkan melalui tiub Teflon (diameter dalam 2 mm) ke dalam jarum keluli tahan karat 30G (kapilari logam). Aliran air dikawal oleh tekanan udara di dalam botol, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2b. Jarum dipasang pada konsol Teflon dan boleh dilaraskan secara manual pada jarak tertentu dari elektrod balas. Elektrod balas ialah cakera aluminium yang digilap dengan lubang di tengah untuk pensampelan. Di bawah elektrod balas ialah corong pensampelan aluminium, yang disambungkan ke persediaan eksperimen yang lain melalui port pensampelan (Rajah 2b). Untuk mengelakkan pengumpulan cas yang boleh mengganggu operasi pensampel, semua komponen pensampelan dibumikan secara elektrik.
(a) Sistem Penjanaan Nanostruktur Air Kejuruteraan (EWNS). (b) Keratan rentas pensampel dan penyembur elektro, menunjukkan parameter yang paling penting. (c) Persediaan eksperimen untuk penyahaktifan bakteria.
Sistem penjanaan EWNS yang diterangkan di atas mampu mengubah parameter operasi utama untuk memudahkan penalaan halus sifat EWNS. Laraskan voltan yang dikenakan (V), jarak antara jarum dan elektrod balas (L), dan aliran air (φ) melalui kapilari untuk menala halus ciri-ciri EWNS. Simbol yang digunakan untuk mewakili kombinasi yang berbeza: [V (kV), L (cm)]. Laraskan aliran air untuk mendapatkan kon Taylor yang stabil pada set tertentu [V, L]. Untuk tujuan kajian ini, diameter apertur elektrod balas (D) dikekalkan pada 0.5 inci (1.29 cm).
Disebabkan geometri dan asimetri yang terhad, kekuatan medan elektrik tidak dapat dikira daripada prinsip pertama. Sebaliknya, perisian QuickField™ (Svendborg, Denmark)19 telah digunakan untuk mengira medan elektrik. Medan elektrik tidak seragam, jadi nilai medan elektrik di hujung kapilari telah digunakan sebagai nilai rujukan untuk pelbagai konfigurasi.
Semasa kajian, beberapa kombinasi voltan dan jarak antara jarum dan elektrod balas telah dinilai dari segi pembentukan kon Taylor, kestabilan kon Taylor, kestabilan penghasilan EWNS dan kebolehulangan. Pelbagai kombinasi ditunjukkan dalam Jadual Tambahan S1.
Output sistem penjanaan EWNS disambungkan terus kepada Penganalisis Saiz Zarah Mobiliti Pengimbas (SMPS, Model 3936, TSI, Shoreview, MN) untuk pengukuran kepekatan bilangan zarah, serta kepada Elektrometer Aerosol Faraday (TSI, Model 3068B, Shoreview, MN). ) untuk arus aerosol diukur seperti yang diterangkan dalam penerbitan kami sebelum ini. Kedua-dua SMPS dan elektrometer aerosol disampel pada kadar aliran 0.5 L/min (jumlah aliran sampel 1 L/min). Bilangan kepekatan zarah dan aliran aerosol diukur selama 120 saat. Pengukuran diulang sebanyak 30 kali. Berdasarkan pengukuran arus, jumlah cas aerosol dikira dan purata cas EWNS dianggarkan untuk jumlah bilangan zarah EWNS terpilih yang diberikan. Kos purata EWNS boleh dikira menggunakan Persamaan (1):
dengan IEl ialah arus yang diukur, NSMPS ialah kepekatan digital yang diukur dengan SMPS dan φEl ialah kadar aliran setiap elektrometer.
Oleh kerana kelembapan relatif (RH) mempengaruhi cas permukaan, suhu dan (RH) dikekalkan malar semasa eksperimen pada suhu 21°C dan 45%.
Mikroskopi daya atom (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) dan prob AC260T (Olympus, Tokyo, Jepun) telah digunakan untuk mengukur saiz dan jangka hayat EWNS. Frekuensi pengimbasan AFM ialah 1 Hz, kawasan pengimbasan ialah 5 μm × 5 μm, dan 256 garisan imbasan. Semua imej telah menjalani penjajaran imej tertib pertama menggunakan perisian Asylum (julat topeng 100 nm, ambang 100 pm).
Corong ujian telah dikeluarkan dan permukaan mika diletakkan pada jarak 2.0 cm dari elektrod balas untuk masa purata 120 s bagi mengelakkan aglomerasi zarah dan pembentukan titisan yang tidak sekata pada permukaan mika. EWNS disembur terus ke permukaan mika yang baru dipotong (Ted Pella, Redding, CA). Imej permukaan mika sejurus selepas percikan AFM. Sudut sentuhan permukaan mika yang baru dipotong dan tidak diubah suai adalah hampir dengan 0°, jadi EVNS diagihkan pada permukaan mika dalam bentuk kubah. Diameter (a) dan ketinggian (h) titisan yang meresap diukur terus daripada topografi AFM dan digunakan untuk mengira isipadu resapan berkubah EWNS menggunakan kaedah yang telah disahkan sebelum ini. Dengan mengandaikan EWNS onboard mempunyai isipadu yang sama, diameter setara boleh dikira menggunakan Persamaan (2):
Berdasarkan kaedah yang telah kami bangunkan sebelum ini, perangkap spin resonans spin elektron (ESR) telah digunakan untuk mengesan kehadiran perantaraan radikal jangka pendek dalam EWNS. Aerosol telah digelembungkan melalui sparger Midget 650 μm (Ace Glass, Vineland, NJ) yang mengandungi larutan 235 mM DEPMPO(5-(dietoksifosforil)-5-metil-1-pirolin-N-oksida) (Oxis International Inc.). Portland, Oregon). Semua pengukuran ESR telah dilakukan menggunakan spektrometer Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) dan sel panel rata. Perisian Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) telah digunakan untuk mengumpul dan menganalisis data. Penentuan ciri-ciri ROS hanya dijalankan untuk satu set keadaan operasi [-6.5 kV, 4.0 cm2]. Kepekatan EWNS telah diukur menggunakan SMPS selepas mengambil kira kehilangan EWNS dalam impaktor.
Tahap ozon dipantau menggunakan 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Bagi semua sifat EWNS, nilai min digunakan sebagai nilai pengukuran, dan sisihan piawai digunakan sebagai ralat pengukuran. Ujian-t telah dijalankan untuk membandingkan nilai atribut EWNS yang dioptimumkan dengan nilai EWNS asas yang sepadan.
Rajah 2c menunjukkan sistem "tarikan" pemendakan elektrostatik (EPES) yang telah dibangunkan dan dicirikan sebelum ini yang boleh digunakan untuk penghantaran EWNS yang disasarkan di permukaan. EPES menggunakan cas EVNS yang boleh "dipandu" terus ke permukaan sasaran di bawah pengaruh medan elektrik yang kuat. Butiran sistem EPES dibentangkan dalam penerbitan terbaru oleh Pyrgiotakis et al. 11. Oleh itu, EPES terdiri daripada ruang PVC bercetak 3D dengan hujung tirus dan mengandungi dua plat logam keluli tahan karat selari (keluli tahan karat 304, bersalut cermin) di tengah dengan jarak 15.24 cm. Papan disambungkan kepada sumber voltan tinggi luaran (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), plat bawah sentiasa disambungkan kepada voltan positif, dan plat atas sentiasa disambungkan ke tanah (tanah terapung). Dinding ruang ditutup dengan kerajang aluminium, yang dibumikan secara elektrik untuk mengelakkan kehilangan zarah. Ruang ini mempunyai pintu pemuatan hadapan yang tertutup yang membolehkan permukaan ujian diletakkan di atas penyangga plastik yang mengangkatnya di atas plat logam bawah untuk mengelakkan gangguan voltan tinggi.
Kecekapan pemendapan EWNS dalam EPES dikira mengikut protokol yang dibangunkan sebelum ini yang diperincikan dalam Rajah Tambahan S111.
Sebagai ruang kawalan, ruang aliran silinder kedua disambungkan secara bersiri ke sistem EPES, di mana penapis HEPA perantaraan digunakan untuk menyingkirkan EWNS. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2c, aerosol EWNS dipam melalui dua ruang terbina dalam. Penapis antara bilik kawalan dan EPES menyingkirkan sebarang EWNS yang tinggal yang menghasilkan suhu (T), kelembapan relatif (RH) dan tahap ozon yang sama.
Mikroorganisma bawaan makanan yang penting telah didapati mencemari makanan segar seperti E. coli (ATCC #27325), penunjuk najis, Salmonella enterica (ATCC #53647), patogen bawaan makanan, Listeria tidak berbahaya (ATCC #33090), pengganti untuk Listeria monocytogenes patogenik, yang berasal dari ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), pengganti yis pembusuk, dan bakteria tidak aktif yang lebih tahan, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Beli kotak tomato anggur organik secara rawak dari pasar tempatan anda dan sejukkan pada suhu 4°C sehingga digunakan (sehingga 3 hari). Semua tomato eksperimen adalah sama saiz, kira-kira 1/2 inci diameter.
Protokol kultur, inokulasi, pendedahan dan kiraan koloni diperincikan dalam penerbitan kami sebelum ini dan diperincikan dalam Data Tambahan. Keberkesanan EWNS dinilai dengan mendedahkan tomato yang diinokulasi kepada 40,000 #/cm3 selama 45 minit. Secara ringkas, tiga biji tomato digunakan untuk menilai mikroorganisma yang terselamat pada masa t = 0 minit. Tiga biji tomato diletakkan di dalam EPES dan didedahkan kepada EWNS pada 40,000 #/cc (tomato yang terdedah kepada EWNS) dan tiga biji tomato yang lain diletakkan di dalam ruang kawalan (tomato kawalan). Pemprosesan tambahan tomato dalam kedua-dua kumpulan tidak dijalankan. Tomato yang terdedah kepada EWNS dan tomato kawalan telah dikeluarkan selepas 45 minit untuk menilai kesan EWNS.
Setiap eksperimen dijalankan dalam tiga kali ganda. Analisis data dilakukan mengikut protokol yang diterangkan dalam Data Tambahan.
Mekanisme penyahaktifan dinilai melalui pemendapan sampel EWNS yang terdedah (45 minit pada kepekatan aerosol EWNS 40,000 #/cm3) dan sampel bakteria tidak berbahaya E. coli, Salmonella enterica dan Lactobacillus yang tidak disinari. Zarah-zarah tersebut difiksasi dalam 2.5% glutaraldehida, 1.25% paraformaldehid dan 0.03% asid pikrik dalam 0.1 M penimbal natrium kakodilat (pH 7.4) selama 2 jam pada suhu bilik. Selepas dibasuh, pascafiksasi dengan 1% osmium tetroksida (OsO4)/1.5% kalium ferosianda (KFeCN6) selama 2 jam, basuh 3 kali dalam air dan inkubasi dalam 1% uranil asetat selama 1 jam, kemudian basuh dua kali dalam air, kemudian dehidratkan selama 10 minit dalam alkohol 50%, 70%, 90%, 100%. Sampel kemudiannya diletakkan di dalam propilena oksida selama 1 jam dan diresapi dengan campuran 1:1 propilena oksida dan TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Sampel dibenamkan dalam TAAB Epon dan dipolimerisasi pada suhu 60°C selama 48 jam. Resin berbutir yang telah diawet dipotong dan divisualisasikan oleh TEM menggunakan mikroskop elektron penghantaran konvensional JEOL 1200EX (JEOL, Tokyo, Jepun) yang dilengkapi dengan kamera CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, USA).
Semua eksperimen dijalankan dalam tiga kali ganda. Bagi setiap titik masa, pencucian bakteria telah dibiakkan dalam tiga kali ganda, menghasilkan sejumlah sembilan titik data setiap titik, yang puratanya digunakan sebagai kepekatan bakteria untuk mikroorganisma tertentu tersebut. Sisihan piawai digunakan sebagai ralat pengukuran. Semua titik dikira.
Logaritma penurunan kepekatan bakteria berbanding t = 0 min dikira menggunakan formula berikut:
di mana C0 ialah kepekatan bakteria dalam sampel kawalan pada masa 0 (iaitu selepas permukaan kering tetapi sebelum diletakkan di dalam ruang) dan Cn ialah kepekatan bakteria di permukaan selepas n minit pendedahan.
Untuk mengambil kira degradasi semula jadi bakteria semasa pendedahan selama 45 minit, pengurangan log berbanding kawalan selepas 45 minit juga dikira seperti berikut:
di mana Cn ialah kepekatan bakteria dalam sampel kawalan pada masa n dan Cn-Kawalan ialah kepekatan bakteria kawalan pada masa n. Data dibentangkan sebagai pengurangan log berbanding kawalan (tiada pendedahan EWNS).
Semasa kajian, beberapa kombinasi voltan dan jarak antara jarum dan elektrod balas telah dinilai dari segi pembentukan kon Taylor, kestabilan kon Taylor, kestabilan penghasilan EWNS, dan kebolehulangan. Pelbagai kombinasi ditunjukkan dalam Jadual Tambahan S1. Dua kes yang menunjukkan sifat stabil dan boleh dihasilkan semula (kon Taylor, penjanaan EWNS, dan kestabilan dari semasa ke semasa) telah dipilih untuk kajian komprehensif. Pada rajah, Rajah 3 menunjukkan keputusan untuk cas, saiz, dan kandungan ROS dalam kedua-dua kes. Keputusan juga diringkaskan dalam Jadual 1. Untuk rujukan, kedua-dua Rajah 3 dan Jadual 1 merangkumi sifat EWNS8, 9, 10, 11 yang tidak dioptimumkan yang disintesis sebelum ini (garis dasar-EWNS). Pengiraan kepentingan statistik menggunakan ujian-t dua hujung diterbitkan semula dalam Jadual Tambahan S2. Di samping itu, data tambahan termasuk kajian tentang kesan diameter lubang persampelan elektrod balas (D) dan jarak antara elektrod pembumian dan hujung (L) (Rajah Tambahan S2 dan S3).
(ac) Taburan saiz yang diukur oleh AFM. (df) Ciri cas permukaan. (g) Pencirian ROS bagi EPR.
Penting juga untuk diperhatikan bahawa bagi semua keadaan di atas, arus pengionan yang diukur adalah antara 2 dan 6 μA dan voltan antara -3.8 dan -6.5 kV, menghasilkan penggunaan kuasa kurang daripada 50 mW untuk modul sentuhan penjanaan EWNS tunggal ini. Walaupun EWNS disintesis di bawah tekanan tinggi, tahap ozon adalah sangat rendah, tidak pernah melebihi 60 ppb.
Rajah Tambahan S4 menunjukkan medan elektrik simulasi untuk senario [-6.5 kV, 4.0 cm] dan [-3.8 kV, 0.5 cm]. Bagi senario [-6.5 kV, 4.0 cm] dan [-3.8 kV, 0.5 cm], pengiraan medan masing-masing ialah 2 × 105 V/m dan 4.7 × 105 V/m. Ini dijangkakan, kerana dalam kes kedua, nisbah voltan-jarak adalah jauh lebih tinggi.
Pada rajah 3a, b menunjukkan diameter EWNS yang diukur dengan AFM8. Purata diameter EWNS yang dikira masing-masing ialah 27 nm dan 19 nm untuk skema [-6.5 kV, 4.0 cm] dan [-3.8 kV, 0.5 cm]. Bagi senario [-6.5 kV, 4.0 cm] dan [-3.8 kV, 0.5 cm], sisihan piawai geometri bagi taburan masing-masing ialah 1.41 dan 1.45, menunjukkan taburan saiz yang sempit. Kedua-dua saiz min dan sisihan piawai geometri adalah sangat hampir dengan EWNS asas, masing-masing pada 25 nm dan 1.41. Pada rajah 3c menunjukkan taburan saiz EWNS asas yang diukur menggunakan kaedah yang sama di bawah keadaan yang sama.
Pada rajah 3d, e menunjukkan keputusan pencirian cas. Data adalah ukuran purata bagi 30 ukuran kepekatan (#/cm3) dan arus (I) serentak. Analisis menunjukkan bahawa cas purata pada EWNS masing-masing ialah 22 ± 6 e- dan 44 ± 6 e- untuk [-6.5 kV, 4.0 cm] dan [-3.8 kV, 0.5 cm]. Ia mempunyai cas permukaan yang jauh lebih tinggi berbanding EWNS asas (10 ± 2 e-), dua kali lebih besar daripada senario [-6.5 kV, 4.0 cm] dan empat kali lebih besar daripada [-3 .8 kV, 0.5 cm]. Rajah 3f menunjukkan data cas untuk Baseline-EWNS.
Daripada peta kepekatan nombor EWNS (Rajah Tambahan S5 dan S6), dapat dilihat bahawa senario [-6.5 kV, 4.0 cm] mempunyai zarah yang jauh lebih banyak daripada senario [-3.8 kV, 0.5 cm]. Perlu juga diperhatikan bahawa kepekatan nombor EWNS dipantau sehingga 4 jam (Rajah Tambahan S5 dan S6), di mana kestabilan penjanaan EWNS menunjukkan tahap kepekatan nombor zarah yang sama dalam kedua-dua kes.
Pada rajah 3g, spektrum EPR selepas penolakan kawalan EWNS yang dioptimumkan (latar belakang) pada [-6.5 kV, 4.0 cm2]. Spektrum ROS juga dibandingkan dengan senario Baseline-EWNS dalam karya yang diterbitkan sebelum ini. Bilangan EWNS yang bertindak balas dengan perangkap spin dikira sebagai 7.5 × 104 EWNS/s, yang serupa dengan Baseline-EWNS8 yang diterbitkan sebelum ini. Spektrum EPR jelas menunjukkan kehadiran dua jenis ROS, dengan O2- sebagai spesies utama dan OH• kurang banyak. Di samping itu, perbandingan langsung keamatan puncak menunjukkan bahawa EWNS yang dioptimumkan mempunyai kandungan ROS yang jauh lebih tinggi berbanding EWNS garis dasar.
Rajah 4 menunjukkan kecekapan pemendapan EWNS dalam EPES. Data tersebut juga diringkaskan dalam Jadual I dan dibandingkan dengan data EWNS asal. Bagi kedua-dua kes EUNS, pemendapan adalah hampir 100% walaupun pada voltan rendah 3.0 kV. Biasanya, 3.0 kV mencukupi untuk pemendapan 100%, tanpa mengira perubahan cas permukaan. Di bawah keadaan yang sama, kecekapan pemendapan Baseline-EWNS hanya 56% disebabkan oleh casnya yang lebih rendah (purata 10 elektron setiap EWNS).
Pada rajah 5 dan jadual 2, nilai penyahaktifan mikroorganisma yang diinokulasi pada permukaan tomato dirumuskan selepas terdedah kepada kira-kira 40,000 #/cm3 EWNS selama 45 minit pada mod optimum [-6.5 kV, 4.0 cm]. E. coli dan Lactobacillus innocuous yang diinokulasi menunjukkan pengurangan ketara sebanyak 3.8 log semasa pendedahan selama 45 minit. Di bawah keadaan yang sama, S. enterica mengalami penurunan sebanyak 2.2 log, manakala S. cerevisiae dan M. parafortutum mengalami penurunan sebanyak 1.0 log.
Mikrograf elektron (Rajah 6) menggambarkan perubahan fizikal yang disebabkan oleh EWNS pada sel Escherichia coli, Streptococcus, dan Lactobacillus yang tidak berbahaya yang menyebabkan penyahaktifannya. Bakteria kawalan mempunyai membran sel yang utuh, manakala bakteria yang terdedah mempunyai membran luar yang rosak.
Pengimejan mikroskop elektron bagi bakteria kawalan dan bakteria yang terdedah mendedahkan kerosakan membran.
Data mengenai sifat fizikokimia EWNS yang dioptimumkan secara kolektif menunjukkan bahawa sifat (cas permukaan dan kandungan ROS) EWNS telah bertambah baik dengan ketara berbanding data asas EWNS yang diterbitkan sebelum ini8,9,10,11. Sebaliknya, saiznya kekal dalam julat nanometer, sangat serupa dengan keputusan yang dilaporkan sebelum ini, membolehkannya kekal di udara untuk jangka masa yang lama. Polidispersiti yang diperhatikan boleh dijelaskan oleh perubahan cas permukaan yang menentukan saiz EWNS, kerawakan kesan Rayleigh, dan potensi penggabungan. Walau bagaimanapun, seperti yang diperincikan oleh Nielsen et al. 22, cas permukaan yang tinggi mengurangkan penyejatan dengan meningkatkan tenaga/ketegangan permukaan titisan air secara berkesan. Dalam penerbitan kami sebelum ini8 teori ini telah disahkan secara eksperimen untuk mikrotitisan 22 dan EWNS. Kehilangan cas semasa kerja lebih masa juga boleh menjejaskan saiz dan menyumbang kepada taburan saiz yang diperhatikan.
Di samping itu, cas setiap struktur adalah kira-kira 22-44 e-, bergantung pada situasi, yang jauh lebih tinggi berbanding EWNS asas, yang mempunyai cas purata 10 ± 2 elektron setiap struktur. Walau bagaimanapun, perlu diingatkan bahawa ini adalah cas purata EWNS. Seto et al. Telah ditunjukkan bahawa cas tersebut tidak homogen dan mengikuti taburan log-normal21. Berbanding dengan kajian kami sebelum ini, penggandaan cas permukaan menggandakan kecekapan pemendapan dalam sistem EPES kepada hampir 100%11.