გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature.com-ს. თქვენს მიერ გამოყენებულ ბრაუზერის ვერსიას CSS-ის შეზღუდული მხარდაჭერა აქვს. საუკეთესო გამოცდილებისთვის გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). ამასობაში, მხარდაჭერის უწყვეტი უზრუნველყოფის მიზნით, საიტს სტილებისა და JavaScript-ის გარეშე ვაჩვენებთ.
ცოტა ხნის წინ შემუშავდა ქიმიური ნივთიერებებისგან თავისუფალი ანტიმიკრობული პლატფორმა, რომელიც დაფუძნებულია ნანოტექნოლოგიაზე, რომელიც იყენებს ხელოვნურ წყლის ნანოსტრუქტურებს (EWNS). EWNS-ებს აქვთ მაღალი ზედაპირული მუხტი და გაჯერებულია რეაქტიული ჟანგბადის სახეობებით (ROS), რომლებსაც შეუძლიათ ურთიერთქმედება და მათი ინაქტივაცია რიგ მიკროორგანიზმებთან, მათ შორის საკვებით გადამდები პათოგენებთან. აქ ნაჩვენებია, რომ სინთეზის დროს მათი თვისებების დახვეწა და ოპტიმიზაცია შესაძლებელია მათი ანტიბაქტერიული პოტენციალის შემდგომი გაძლიერების მიზნით. EWNS ლაბორატორიული პლატფორმა შექმნილია EWNS-ის თვისებების დახვეწისთვის სინთეზის პარამეტრების შეცვლით. EWNS თვისებების (მუხტი, ზომა და ROS-ის შემცველობა) დახასიათება თანამედროვე ანალიტიკური მეთოდების გამოყენებით. გარდა ამისა, ისინი შეფასდა მათი მიკრობული ინაქტივაციის პოტენციალის მიხედვით საკვებით გადამდები მიკროორგანიზმების მიმართ, როგორიცაა Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum და Saccharomyces cerevisiae. აქ წარმოდგენილი შედეგები აჩვენებს, რომ EWNS-ის თვისებების დახვეწა შესაძლებელია სინთეზის დროს, რაც იწვევს ინაქტივაციის ეფექტურობის ექსპონენციალურ ზრდას. კერძოდ, ზედაპირული მუხტი გაიზარდა ოთხჯერ და რეაქტიული ჟანგბადის სახეობები გაიზარდა. მიკრობების მოცილების სიჩქარე მიკრობულად დამოკიდებული იყო და მერყეობდა 1.0-დან 3.8 log-მდე 40,000 #cc EWNS აეროზოლის დოზის 45-წუთიანი ზემოქმედების შემდეგ.
მიკრობული დაბინძურება საკვებით გამოწვეული დაავადებების მთავარი მიზეზია, რომელიც გამოწვეულია პათოგენების ან მათი ტოქსინების მიღებით. მხოლოდ შეერთებულ შტატებში საკვებით გამოწვეული დაავადებები ყოველწლიურად დაახლოებით 76 მილიონ დაავადებას, 325 000 ჰოსპიტალიზაციას და 5 000 სიკვდილს იწვევს1. გარდა ამისა, შეერთებული შტატების სოფლის მეურნეობის დეპარტამენტი (USDA) ვარაუდობს, რომ ახალი პროდუქტების მოხმარების ზრდა შეერთებულ შტატებში საკვებით გამოწვეული დაავადებების 48%-ის მიზეზია2. საკვებით გამოწვეული პათოგენებით გამოწვეული დაავადებებისა და სიკვდილიანობის ღირებულება შეერთებულ შტატებში ძალიან მაღალია, დაავადებათა კონტროლისა და პრევენციის ცენტრების (CDC) შეფასებით, წელიწადში 15.6 მილიარდ აშშ დოლარზე მეტია3.
ამჟამად, საკვების უვნებლობის უზრუნველსაყოფად ქიმიური4, რადიაციული5 და თერმული6 ანტიმიკრობული ჩარევები ძირითადად ხორციელდება წარმოების ჯაჭვის გასწვრივ შეზღუდულ კრიტიკულ საკონტროლო წერტილებში (CCP) (ჩვეულებრივ, მოსავლის აღების შემდეგ და/ან შეფუთვის დროს) და არა უწყვეტად. ამრიგად, ისინი მიდრეკილნი არიან ჯვარედინი დაბინძურებისკენ. 7. საკვებით გამოწვეული დაავადებებისა და საკვების გაფუჭების უკეთესი კონტროლისთვის საჭიროა ანტიმიკრობული ჩარევები, რომელთა გამოყენება პოტენციურად შესაძლებელია ფერმიდან სუფრამდე მთელი პროცესის განმავლობაში, გარემოზე ზემოქმედებისა და ხარჯების შემცირების პარალელურად.
ცოტა ხნის წინ შემუშავდა ქიმიური ნივთიერებებისგან თავისუფალი, ნანოტექნოლოგიებზე დაფუძნებული ანტიმიკრობული პლატფორმა, რომელსაც შეუძლია ზედაპირული და ჰაერწვეთოვანი ბაქტერიების ინაქტივაცია ხელოვნური წყლის ნანოსტრუქტურების (EWNS) გამოყენებით. EWNS სინთეზირებული იქნა ორი პარალელური პროცესის, ელექტროშესხურებისა და წყლის იონიზაციის გამოყენებით (სურ. 1ა). წინა კვლევებმა აჩვენა, რომ EWNS-ს აქვს ფიზიკური და ბიოლოგიური თვისებების უნიკალური ნაკრები8,9,10. EWNS-ს საშუალოდ 10 ელექტრონი აქვს თითო სტრუქტურაზე და საშუალო ნანომასშტაბიანი ზომა 25 ნმ (სურ. 1ბ,გ)8,9,10. გარდა ამისა, ელექტრონული სპინური რეზონანსის (ESR) მიხედვით, EWNS შეიცავს დიდი რაოდენობით რეაქტიული ჟანგბადის სახეობებს (ROS), ძირითადად ჰიდროქსილის (OH•) და სუპეროქსიდის (O2-) რადიკალებს (სურ. 1გ)8. EVNS დიდი ხნის განმავლობაში იმყოფება ჰაერში და შეიძლება შეეჯახოს ჰაერში შეწონილ და ზედაპირზე არსებულ მიკროორგანიზმებს, გადასცეს მათი ROS დატვირთვა და გამოიწვიოს მიკროორგანიზმების ინაქტივაცია (სურ. 1დ). ამ ადრეულმა კვლევებმა ასევე აჩვენა, რომ EWNS-ს შეუძლია ურთიერთქმედება სხვადასხვა გრამუარყოფით და გრამდადებით ბაქტერიებთან, მათ შორის მიკობაქტერიებთან, ზედაპირებსა და ჰაერში და მათი ინაქტივაცია. ტრანსმისიული ელექტრონული მიკროსკოპიით დადგინდა, რომ ინაქტივაცია გამოწვეული იყო უჯრედის მემბრანის დაზიანებით. გარდა ამისა, მწვავე ინჰალაციის კვლევებმა აჩვენა, რომ EWNS-ის მაღალი დოზები არ იწვევს ფილტვების დაზიანებას ან ანთებას.
(ა) ელექტროშესხურება ხდება მაშინ, როდესაც მაღალი ძაბვა გამოიყენება სითხის შემცველ კაპილარულ მილსა და საპირისპირო ელექტროდს შორის. (ბ) მაღალი წნევის გამოყენება იწვევს ორ განსხვავებულ ფენომენს: (i) წყლის ელექტროშესხურებას და (ii) რეაქტიული ჟანგბადის სახეობების (იონების) წარმოქმნას, რომლებიც ჩაჭედილია EWNS-ში. (გ) EWNS-ის უნიკალური სტრუქტურა. (დ) ნანომასშტაბიანი ბუნების გამო, EWNS ძალიან მობილურია და შეუძლია ურთიერთქმედება ჰაერწვეთოვან პათოგენებთან.
ასევე ცოტა ხნის წინ დადასტურდა EWNS ანტიმიკრობული პლატფორმის უნარი, ინაქტივირება გაუკეთოს საკვების ზედაპირზე არსებულ საკვებში გადამდები მიკროორგანიზმებს. ასევე ნაჩვენებია, რომ EWNS-ის ზედაპირული მუხტი ელექტრულ ველთან ერთად შეიძლება გამოყენებულ იქნას მიზნობრივი მიწოდების მისაღწევად. გარდა ამისა, ორგანული პომიდვრის წინასწარი შედეგები დაახლოებით 50,000#/სმ3 EWNS-ზე 90 წუთიანი ზემოქმედების შემდეგ იმედისმომცემი იყო, დაფიქსირდა სხვადასხვა საკვებისმიერი მიკროორგანიზმები, როგორიცაა E. coli და Listeria 11. გარდა ამისა, წინასწარმა ორგანოლეპტიკურმა ტესტებმა არ აჩვენა სენსორული ეფექტები საკონტროლო პომიდორთან შედარებით. მიუხედავად იმისა, რომ ინაქტივაციის ეს საწყისი შედეგები იმედისმომცემია საკვების უვნებლობის აპლიკაციებისთვის, თუნდაც EWNS-ის ძალიან დაბალი დოზებით, 50,000#/cc. იხ., ცხადია, რომ ინაქტივაციის უფრო მაღალი პოტენციალი უფრო სასარგებლო იქნებოდა ინფექციისა და გაფუჭების რისკის შემდგომი შემცირებისთვის.
აქ ჩვენი კვლევა ფოკუსირებული იქნება EWNS გენერაციის პლატფორმის შემუშავებაზე, რათა შესაძლებელი გახდეს სინთეზის პარამეტრების დახვეწა და EWNS-ის ფიზიკურ-ქიმიური თვისებების ოპტიმიზაცია მათი ანტიბაქტერიული პოტენციალის გასაძლიერებლად. კერძოდ, ოპტიმიზაცია ფოკუსირებულია მათი ზედაპირული მუხტის გაზრდაზე (მიზნობრივი მიწოდების გასაუმჯობესებლად) და ROS შემცველობის გაზრდაზე (ინაქტივაციის ეფექტურობის გასაუმჯობესებლად). ოპტიმიზებული ფიზიკურ-ქიმიური თვისებების (ზომა, მუხტი და ROS შემცველობა) დახასიათება თანამედროვე ანალიტიკური მეთოდების გამოყენებით და ისეთი გავრცელებული საკვები მიკროორგანიზმების გამოყენება, როგორიცაა E.
EVNS სინთეზირებული იქნა მაღალი სისუფთავის წყლის (18 MΩ სმ–1) ერთდროული ელექტროშესხურებითა და იონიზაციით. ელექტრო ნებულაიზერი 12, როგორც წესი, გამოიყენება სითხეების ატომიზაციისა და კონტროლირებადი ზომის პოლიმერული და კერამიკული ნაწილაკების 13 და ბოჭკოების 14 სინთეზისთვის.
როგორც წინა პუბლიკაციებში 8, 9, 10, 11 დეტალურად არის აღწერილი, ტიპურ ექსპერიმენტში, ლითონის კაპილარსა და დამიწებულ საპირისპირო ელექტროდს შორის მაღალი ძაბვა გამოიყენებოდა. ამ პროცესის დროს ორი განსხვავებული ფენომენი ხდება: i) ელექტროშესხურება და ii) წყლის იონიზაცია. ორ ელექტროდს შორის ძლიერი ელექტრული ველი იწვევს კონდენსირებული წყლის ზედაპირზე უარყოფითი მუხტების დაგროვებას, რაც იწვევს ტეილორის კონუსების წარმოქმნას. შედეგად, წარმოიქმნება მაღალმუხტიანი წყლის წვეთები, რომლებიც აგრძელებენ დაშლას უფრო პატარა ნაწილაკებად, როგორც ეს რელეის თეორიაშია16. ამავდროულად, ძლიერი ელექტრული ველები იწვევს წყლის ზოგიერთი მოლეკულის დაშლას და ელექტრონების მოცილებას (იონიზაციას), რაც იწვევს დიდი რაოდენობით რეაქტიული ჟანგბადის სახეობების (ROS) წარმოქმნას17. ერთდროულად წარმოქმნილი ROS18 კაფსულირებულია EWNS-ში (სურ. 1გ).
ნახ. 2ა-ზე ნაჩვენებია EWNS გენერაციის სისტემა, რომელიც შემუშავებულია და გამოიყენება ამ კვლევაში EWNS სინთეზში. დახურულ ბოთლში შენახული გასუფთავებული წყალი ტეფლონის მილის (2 მმ შიდა დიამეტრი) მეშვეობით მიეწოდებოდა 30G უჟანგავი ფოლადის ნემსს (ლითონის კაპილარი). წყლის ნაკადი კონტროლდება ბოთლში ჰაერის წნევით, როგორც ეს ნაჩვენებია ნახ. 2ბ-ზე. ნემსი დამონტაჟებულია ტეფლონის კონსოლზე და მისი ხელით რეგულირება შესაძლებელია საპირისპირო ელექტროდიდან გარკვეულ მანძილზე. საპირისპირო ელექტროდი არის გაპრიალებული ალუმინის დისკი, რომლის ცენტრში არის ნახვრეტი ნიმუშების ასაღებად. საპირისპირო ელექტროდის ქვემოთ არის ალუმინის ნიმუშის ძაბრი, რომელიც დაკავშირებულია ექსპერიმენტული სისტემის დანარჩენ ნაწილთან ნიმუშის აღების პორტის საშუალებით (ნახ. 2ბ). მუხტის დაგროვების თავიდან ასაცილებლად, რამაც შეიძლება შეაფერხოს ნიმუშის აღების აპარატის მუშაობა, ნიმუშის აღების ყველა კომპონენტი ელექტრონულად არის დამიწებული.
(ა) წყლის ნანოსტრუქტურის გენერირების ინჟინერიული სისტემა (EWNS). (ბ) სინჯის ამღების და ელექტროსპრეის განივი კვეთა, რომელიც აჩვენებს ყველაზე მნიშვნელოვან პარამეტრებს. (გ) ბაქტერიების ინაქტივაციის ექსპერიმენტული მოწყობა.
ზემოთ აღწერილ EWNS გენერაციის სისტემას შეუძლია შეცვალოს ძირითადი ოპერაციული პარამეტრები EWNS თვისებების ზუსტი რეგულირების გასაადვილებლად. EWNS მახასიათებლების ზუსტი რეგულირებისთვის, დაარეგულირეთ გამოყენებული ძაბვა (V), ნემსსა და საპირისპირო ელექტროდს შორის მანძილი (L) და კაპილარში წყლის ნაკადი (φ). სხვადასხვა კომბინაციების აღსანიშნავად გამოყენებული სიმბოლოა: [V (kV), L (სმ)]. დაარეგულირეთ წყლის ნაკადი გარკვეული ნაკრების სტაბილური ტეილორის კონუსის მისაღებად [V, L]. ამ კვლევის მიზნებისთვის, საპირისპირო ელექტროდის (D) აპერტურის დიამეტრი შენარჩუნებული იყო 0.5 ინჩის (1.29 სმ) დონეზე.
შეზღუდული გეომეტრიისა და ასიმეტრიის გამო, ელექტრული ველის სიძლიერის გამოთვლა პირველი პრინციპებიდან შეუძლებელია. ამის ნაცვლად, ელექტრული ველის გამოსათვლელად გამოყენებული იქნა QuickField™ პროგრამული უზრუნველყოფა (სვენდბორგი, დანია)19. ელექტრული ველი ერთგვაროვანი არ არის, ამიტომ კაპილარის წვერზე ელექტრული ველის მნიშვნელობა სხვადასხვა კონფიგურაციისთვის საცნობარო მნიშვნელობად იქნა გამოყენებული.
კვლევის დროს შეფასდა ნემსსა და საპირისპირო ელექტროდს შორის ძაბვისა და მანძილის რამდენიმე კომბინაცია ტეილორის კონუსის ფორმირების, ტეილორის კონუსის სტაბილურობის, EWNS წარმოების სტაბილურობისა და რეპროდუცირებადობის თვალსაზრისით. სხვადასხვა კომბინაციები ნაჩვენებია დამატებით ცხრილში S1.
EWNS გენერაციის სისტემის გამომავალი პირდაპირ დაკავშირებული იყო სკანირების მობილობის ნაწილაკების ზომის ანალიზატორთან (SMPS, მოდელი 3936, TSI, Shoreview, MN) ნაწილაკების რაოდენობის კონცენტრაციის გაზომვისთვის, ასევე აეროზოლური ფარადეის ელექტრომეტრთან (TSI, მოდელი 3068B, Shoreview, MN). აეროზოლური დენების გაზომვა განხორციელდა ჩვენს წინა პუბლიკაციაში აღწერილი მეთოდით. ​​როგორც SMPS-დან, ასევე აეროზოლური ელექტრომეტრიდან აღებული ნიმუშები აღებული იქნა 0.5 ლ/წთ ნაკადის სიჩქარით (ნიმუშის საერთო ნაკადი 1 ლ/წთ). ნაწილაკების რაოდენობის კონცენტრაცია და აეროზოლის ნაკადი გაიზომა 120 წამის განმავლობაში. გაზომვა მეორდება 30-ჯერ. დენის გაზომვების საფუძველზე, გამოითვლება აეროზოლის მთლიანი მუხტი და შეფასებულია EWNS-ის საშუალო მუხტი შერჩეული EWNS ნაწილაკების მოცემული საერთო რაოდენობისთვის. EWNS-ის საშუალო ღირებულება შეიძლება გამოითვალოს განტოლების (1) გამოყენებით:
სადაც IEl არის გაზომილი დენი, NSMPS არის SMPS-ით გაზომილი ციფრული კონცენტრაცია, ხოლო φEl არის ელექტრომეტრზე ნაკადის სიჩქარე.
რადგან ფარდობითი ტენიანობა (RH) გავლენას ახდენს ზედაპირის მუხტზე, ექსპერიმენტის დროს ტემპერატურა და (RH) მუდმივი იყო, შესაბამისად, 21°C და 45%-ზე.
EWNS-ის ზომისა და სიცოცხლის ხანგრძლივობის გასაზომად გამოყენებული იქნა ატომური ძალის მიკროსკოპია (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, სანტა ბარბარა, კალიფორნია) და AC260T ზონდი (Olympus, ტოკიო, იაპონია). AFM სკანირების სიხშირე იყო 1 ჰც, სკანირების არეალი - 5 μm × 5 μm და 256 სკანირების ხაზი. ყველა სურათი დაექვემდებარა პირველი რიგის გამოსახულების გასწორებას Asylum პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით (ნიღბის დიაპაზონი 100 ნმ, ზღურბლი 100 pm).
სატესტო ძაბრი ამოიღეს და ქარსის ზედაპირი მოათავსეს საპირისპირო ელექტროდიდან 2.0 სმ დაშორებით 120 წამის საშუალო დროით, რათა თავიდან აეცილებინათ ნაწილაკების აგლომერაცია და ქარსის ზედაპირზე არარეგულარული წვეთების წარმოქმნა. EWNS პირდაპირ შეასხურეს ახლად დაჭრილი ქარსის ზედაპირზე (ტედ პელა, რედინგი, კალიფორნია). ქარსის ზედაპირის გამოსახულება AFM-ის გაფრქვევისთანავე. ახლად დაჭრილი, არამოდიფიცირებული ქარსის ზედაპირის კონტაქტის კუთხე ახლოსაა 0°-თან, ამიტომ EVNS ნაწილდება ქარსის ზედაპირზე გუმბათის სახით. დიფუზიური წვეთების დიამეტრი (a) და სიმაღლე (h) გაიზომა პირდაპირ AFM ტოპოგრაფიიდან და გამოყენებული იქნა EWNS-ის გუმბათოვანი დიფუზიის მოცულობის გამოსათვლელად ჩვენი ადრე დადასტურებული მეთოდის გამოყენებით. იმ ვარაუდით, რომ ბორტზე ჩაშენებულ EWNS-ებს აქვთ იგივე მოცულობა, ეკვივალენტური დიამეტრის გამოთვლა შესაძლებელია განტოლების (2) გამოყენებით:
ჩვენს მიერ ადრე შემუშავებული მეთოდის საფუძველზე, EWNS-ში ხანმოკლე სიცოცხლის ხანგრძლივობის რადიკალური შუალედური პროდუქტების არსებობის დასადგენად გამოყენებული იქნა ელექტრონული სპინური რეზონანსის (ESR) სპინური ხაფანგი. აეროზოლები ბუშტუკებით გაიგზავნა 650 μm Midget-ის გამფრქვეველში (Ace Glass, Vineland, NJ), რომელიც შეიცავდა DEPMPO(5-(დიეთოქსიფოსფორილ)-5-მეთილ-1-პიროლინ-N-ოქსიდის) (Oxis International Inc.) 235 mM ხსნარს. ESR-ის ყველა გაზომვა ჩატარდა Bruker EMX სპექტრომეტრის (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) და ბრტყელპანელიანი უჯრედის გამოყენებით. მონაცემების შესაგროვებლად და გასაანალიზებლად გამოყენებული იქნა Acquisit პროგრამული უზრუნველყოფა (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA). ROS-ის მახასიათებლების განსაზღვრა განხორციელდა მხოლოდ ოპერაციული პირობების ნაკრებისთვის [-6.5 კვ, 4.0 სმ]. EWNS კონცენტრაციები გაიზომა SMPS-ის გამოყენებით, იმპაქტორში EWNS დანაკარგების გათვალისწინებით.
ოზონის დონის მონიტორინგი განხორციელდა 205 Dual Beam Ozone Monitor™-ის (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10 გამოყენებით.
EWNS-ის ყველა თვისებისთვის, საშუალო მნიშვნელობა გამოიყენება გაზომვის მნიშვნელობად, ხოლო სტანდარტული გადახრა - გაზომვის შეცდომად. ოპტიმიზებული EWNS ატრიბუტების მნიშვნელობების საბაზო EWNS-ის შესაბამის მნიშვნელობებთან შესადარებლად ჩატარდა T-ტესტები.
სურათი 2გ გვიჩვენებს ადრე შემუშავებულ და დახასიათებულ ელექტროსტატიკური ნალექის (EPES) „მიზიდვის“ სისტემას, რომლის გამოყენება შესაძლებელია EWNS-ის ზედაპირზე მიზნობრივი მიწოდებისთვის. EPES იყენებს EVNS მუხტებს, რომელთა „მიმართვა“ შესაძლებელია უშუალოდ სამიზნის ზედაპირზე ძლიერი ელექტრული ველის ზემოქმედებით. EPES სისტემის დეტალები წარმოდგენილია პირიოტაკისის და სხვების მიერ ბოლოდროინდელ პუბლიკაციაში. 11 ამგვარად, EPES შედგება 3D პრინტერით დაბეჭდილი PVC კამერისგან კონუსური ბოლოებით და შეიცავს ორ პარალელურ უჟანგავი ფოლადის (304 უჟანგავი ფოლადი, სარკისებური საფარით დაფარული) ლითონის ფირფიტას ცენტრში, ერთმანეთისგან 15.24 სმ დაშორებით. დაფები დაკავშირებული იყო გარე მაღალი ძაბვის წყაროსთან (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), ქვედა ფირფიტა ყოველთვის დაკავშირებული იყო დადებით ძაბვასთან, ხოლო ზედა ფირფიტა ყოველთვის დაკავშირებული იყო მიწასთან (მცურავ მიწასთან). კამერის კედლები დაფარულია ალუმინის ფოლგით, რომელიც ელექტრონულად არის დამიწებული ნაწილაკების დაკარგვის თავიდან ასაცილებლად. კამერას აქვს დალუქული წინა ჩატვირთვის კარი, რომელიც საშუალებას იძლევა სატესტო ზედაპირები განთავსდეს პლასტმასის სადგამებზე, რომლებიც მათ ქვედა ლითონის ფირფიტაზე მაღლა აწევს მაღალი ძაბვის ჩარევის თავიდან ასაცილებლად.
EWNS-ის დეპონირების ეფექტურობა EPES-ში გამოითვალა დამატებით ნახაზ S111-ში დეტალურად აღწერილი ადრე შემუშავებული პროტოკოლის მიხედვით.
საკონტროლო კამერის სახით, EPES სისტემასთან მიმდევრობით დაკავშირებული იყო მეორე ცილინდრული ნაკადის კამერა, რომელშიც შუალედური HEPA ფილტრი გამოიყენებოდა EWNS-ის მოსაშორებლად. როგორც ნაჩვენებია ნახაზ 2c-ზე, EWNS აეროზოლი ორი ჩაშენებული კამერის მეშვეობით იტუმბებოდა. საკონტროლო ოთახსა და EPES-ს შორის არსებული ფილტრი აშორებს დარჩენილ EWNS-ს, რის შედეგადაც ტემპერატურა (T), ფარდობითი ტენიანობა (RH) და ოზონის დონე იგივეა.
ახალი საკვების დაბინძურება შესაძლებელია საკვებით გამოწვეული მნიშვნელოვანი მიკროორგანიზმებით, როგორიცაა E. coli (ATCC #27325), ფეკალური ინდიკატორი, Salmonella enterica (ATCC #53647), საკვებით გამოწვეული პათოგენი, Listeria harmless (ATCC #33090), პათოგენური Listeria monocytogenes-ის სუროგატი, რომელიც მიღებულია ATCC (მანასასი, ვირჯინია) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), გაფუჭების საფუარის შემცვლელი და უფრო მდგრადი ინაქტივირებული ბაქტერიიდან, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
ადგილობრივი ბაზრიდან შეიძინეთ ორგანული ყურძნის პომიდვრის შემთხვევითი ყუთები და გამოყენებამდე (3 დღემდე) შეინახეთ მაცივარში 4°C ტემპერატურაზე. ექსპერიმენტული პომიდვრები ერთი ზომის იყო, დიამეტრის დაახლოებით 1/2 ინჩი.
კულტურის, ინოკულაციის, ექსპოზიციისა და კოლონიების დათვლის პროტოკოლები დეტალურად არის აღწერილი ჩვენს წინა პუბლიკაციაში და დამატებით მონაცემებში. EWNS-ის ეფექტურობა შეფასდა ინოკულირებული პომიდვრის 40,000 #/cm3-ზე 45 წუთის განმავლობაში ზემოქმედებით. მოკლედ, გადარჩენილი მიკროორგანიზმების შესაფასებლად გამოყენებული იქნა სამი პომიდორი t = 0 წთ დროში. სამი პომიდორი მოათავსეს EPES-ში და დაექვემდებარა EWNS-ს 40,000 #/cc (EWNS-ის ზემოქმედების ქვეშ მყოფი პომიდვრები), ხოლო დარჩენილი სამი მოათავსეს საკონტროლო კამერაში (საკონტროლო პომიდვრები). ორივე ჯგუფში პომიდვრის დამატებითი დამუშავება არ ჩატარებულა. EWNS-ის ზემოქმედების შესაფასებლად EWNS-ის ზემოქმედების ქვეშ მყოფი პომიდვრები და საკონტროლო პომიდვრები ამოიღეს 45 წუთის შემდეგ.
თითოეული ექსპერიმენტი სამ ეგზემპლარად ჩატარდა. მონაცემთა ანალიზი ჩატარდა დამატებით მონაცემებში აღწერილი პროტოკოლის მიხედვით.
ინაქტივაციის მექანიზმები შეფასდა EWNS-ის ექსპოზიციური ნიმუშების (45 წთ 40,000 #/სმ3 EWNS აეროზოლის კონცენტრაციით) და უვნებელი ბაქტერიების E. coli-ის, Salmonella enterica-ს და Lactobacillus-ის არადასხივებული ნიმუშების დალექვით. ნაწილაკები ფიქსირდებოდა 2.5%-იან გლუტარალდეჰიდში, 1.25%-იან პარაფორმალდეჰიდში და 0.03%-იან პიკრინის მჟავაში 0.1 M ნატრიუმის კაკოდილატის ბუფერში (pH 7.4) 2 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე. გარეცხვის შემდეგ, ფიქსირდებოდა 1%-იანი ოსმიუმის ტეტროქსიდით (OsO4)/1.5%-იანი კალიუმის ფეროციანიდით (KFeCN6) 2 საათის განმავლობაში, 3-ჯერ ირეცხებოდა წყალში და ინკუბირებული იყო 1%-იან ურანილის აცეტატში 1 საათის განმავლობაში, შემდეგ ორჯერ ირეცხებოდა წყალში, შემდეგ კი 10 წუთის განმავლობაში იწვოდა 50%, 70%, 90%, 100% სპირტში. შემდეგ ნიმუშები 1 საათის განმავლობაში მოათავსეს პროპილენოქსიდში და გაჟღენთეს პროპილენოქსიდისა და TAAP Epon-ის (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA) 1:1 ნარევით. ნიმუშები ჩასვეს TAAB Epon-ში და პოლიმერიზდნენ 60°C-ზე 48 საათის განმავლობაში. გამაგრებული გრანულირებული ფისი დაიჭრა და ვიზუალიზაცია მოახდინეს TEM-ით ჩვეულებრივი გამტარი ელექტრონული მიკროსკოპის JEOL 1200EX (JEOL, ტოკიო, იაპონია) გამოყენებით, რომელიც აღჭურვილი იყო AMT 2k CCD კამერით (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, USA).
ყველა ექსპერიმენტი სამჯერ ჩატარდა. თითოეული დროის წერტილისთვის ბაქტერიული გამორეცხვები სამჯერ იყო დათესილი, რის შედეგადაც თითოეულ წერტილში სულ ცხრა მონაცემი იქნა მიღებული, რომელთა საშუალო მაჩვენებელი გამოყენებული იქნა კონკრეტული მიკროორგანიზმის ბაქტერიული კონცენტრაციის სახით. სტანდარტული გადახრა გამოყენებული იქნა გაზომვის შეცდომად. ყველა წერტილი ითვლება.
ბაქტერიების კონცენტრაციის შემცირების ლოგარითმი t = 0 წთ-თან შედარებით გამოითვალა შემდეგი ფორმულის გამოყენებით:
სადაც C0 არის ბაქტერიების კონცენტრაცია საკონტროლო ნიმუშში 0 დროს (ანუ ზედაპირის გაშრობის შემდეგ, მაგრამ კამერაში მოთავსებამდე) და Cn არის ბაქტერიების კონცენტრაცია ზედაპირზე n წუთიანი ზემოქმედების შემდეგ.
45-წუთიანი ზემოქმედების დროს ბაქტერიების ბუნებრივი დეგრადაციის გათვალისწინებით, 45 წუთის შემდეგ კონტროლთან შედარებით ლოგარითმული შემცირება ასევე გამოითვალა შემდეგნაირად:
სადაც Cn არის ბაქტერიების კონცენტრაცია საკონტროლო ნიმუშში n დროს და Cn-კონტროლი არის საკონტროლო ბაქტერიების კონცენტრაცია n დროს. მონაცემები წარმოდგენილია ლოგარითმული შემცირებით საკონტროლო ნიმუშთან შედარებით (EWNS ზემოქმედების გარეშე).
კვლევის დროს შეფასდა ნემსსა და საპირისპირო ელექტროდს შორის ძაბვისა და მანძილის რამდენიმე კომბინაცია ტეილორის კონუსის ფორმირების, ტეილორის კონუსის სტაბილურობის, EWNS წარმოების სტაბილურობისა და რეპროდუცირებადობის თვალსაზრისით. სხვადასხვა კომბინაცია ნაჩვენებია დამატებით ცხრილში S1. ყოვლისმომცველი კვლევისთვის შეირჩა ორი შემთხვევა, რომლებიც აჩვენებს სტაბილურ და რეპროდუცირებად თვისებებს (ტეილორის კონუსი, EWNS წარმოქმნა და დროთა განმავლობაში სტაბილურობა). ნახაზი 3-ზე ნაჩვენებია ROS-ის მუხტის, ზომისა და შემცველობის შედეგები ორივე შემთხვევაში. შედეგები ასევე შეჯამებულია ცხრილში 1. მითითებისთვის, როგორც ნახაზი 3, ასევე ცხრილი 1 მოიცავს ადრე სინთეზირებული არაოპტიმიზებული EWNS8, 9, 10, 11 (საბაზისო EWNS) თვისებებს. ორმხრივი t-ტესტის გამოყენებით სტატისტიკური მნიშვნელობის გამოთვლები ხელახლა გამოქვეყნებულია დამატებით ცხრილში S2. გარდა ამისა, დამატებითი მონაცემები მოიცავს საპირისპირო ელექტროდის ნიმუშის აღების ხვრელის დიამეტრის (D) და დამიწების ელექტროდსა და წვერს შორის მანძილის (L) გავლენის კვლევებს (დამატებითი ნახაზი S2 და S3).
(ac) AFM-ით გაზომილი ზომის განაწილება. (df) ზედაპირული მუხტის მახასიათებელი. (g) EPR-ის ROS დახასიათება.
ასევე მნიშვნელოვანია აღინიშნოს, რომ ყველა ზემოთ ჩამოთვლილი პირობისთვის, გაზომილი იონიზაციის დენი იყო 2-დან 6 μA-მდე და ძაბვა - -3.8-დან -6.5 კვ-მდე, რაც იწვევს ამ ერთჯერადი EWNS თაობის კონტაქტური მოდულის 50 მვტ-ზე ნაკლები ენერგომოხმარებას. მიუხედავად იმისა, რომ EWNS სინთეზირებული იყო მაღალი წნევის ქვეშ, ოზონის დონე ძალიან დაბალი იყო და არასდროს აღემატებოდა 60 ppb-ს.
დამატებითი სურათი S4 გვიჩვენებს სიმულირებულ ელექტრულ ველებს [-6.5 კვ, 4.0 სმ] და [-3.8 კვ, 0.5 სმ] სცენარებისთვის, შესაბამისად. [-6.5 კვ, 4.0 სმ] და [-3.8 კვ, 0.5 სმ] სცენარებისთვის, ველის გამოთვლები შესაბამისად 2 × 105 ვ/მ და 4.7 × 105 ვ/მ-ია. ეს მოსალოდნელია, რადგან მეორე შემთხვევაში ძაბვა-მანძილის თანაფარდობა გაცილებით მაღალია.
ნახ. 3a,b-ზე ნაჩვენებია AFM8-ით გაზომილი EWNS დიამეტრი. გამოთვლილი საშუალო EWNS დიამეტრები იყო 27 ნმ და 19 ნმ [-6.5 კვ, 4.0 სმ] და [-3.8 კვ, 0.5 სმ] სქემებისთვის, შესაბამისად. [-6.5 კვ, 4.0 სმ] და [-3.8 კვ, 0.5 სმ] სცენარებისთვის, განაწილების გეომეტრიული სტანდარტული გადახრები შესაბამისად 1.41 და 1.45-ია, რაც მიუთითებს ზომის ვიწრო განაწილებაზე. როგორც საშუალო ზომა, ასევე გეომეტრიული სტანდარტული გადახრა ძალიან ახლოსაა საბაზისო EWNS-თან, შესაბამისად 25 ნმ და 1.41-ზე. ნახ. 3c-ზე ნაჩვენებია საბაზისო EWNS-ის ზომის განაწილება, რომელიც გაზომილია იმავე მეთოდით იმავე პირობებში.
ნახ. 3d,e-ზე ნაჩვენებია მუხტის დახასიათების შედეგები. მონაცემები წარმოადგენს კონცენტრაციის (#/სმ3) და დენის (I) 30 ერთდროული გაზომვის საშუალო გაზომვებს. ანალიზი აჩვენებს, რომ EWNS-ზე საშუალო მუხტი შესაბამისად 22 ± 6 e- და 44 ± 6 e-ა [-6.5 კვ, 4.0 სმ] და [-3.8 კვ, 0.5 სმ]-სთვის. მათ მნიშვნელოვნად მაღალი ზედაპირული მუხტები აქვთ საბაზისო EWNS-თან შედარებით (10 ± 2 e-), ორჯერ მეტი ვიდრე [-6.5 კვ, 4.0 სმ] სცენარი და ოთხჯერ მეტი ვიდრე [-3.8 კვ, 0.5 სმ] სცენარი. ნახაზი 3f გვიჩვენებს საბაზისო EWNS-ის მუხტის მონაცემებს.
EWNS რიცხვის კონცენტრაციის რუკებიდან (დამატებითი სურათები S5 და S6) ჩანს, რომ [-6.5 კვ, 4.0 სმ] სცენარში ნაწილაკების რაოდენობა მნიშვნელოვნად მეტია, ვიდრე [-3.8 კვ, 0.5 სმ] სცენარში. ასევე აღსანიშნავია, რომ EWNS რიცხვის კონცენტრაციის მონიტორინგი 4 საათამდე ხდებოდა (დამატებითი სურათები S5 და S6), სადაც EWNS გენერაციის სტაბილურობამ ორივე შემთხვევაში ნაწილაკების რიცხვის კონცენტრაციის იგივე დონე აჩვენა.
ნახ. 3g-ზე ნაჩვენებია EPR სპექტრი [-6.5 კვ, 4.0 სმ]-ზე ოპტიმიზებული EWNS კონტროლის (ფონის) გამოკლების შემდეგ. ROS სპექტრები ასევე შედარებული იქნა საბაზისო EWNS სცენართან ადრე გამოქვეყნებულ ნაშრომში. სპინ-ხაფანგებთან რეაქციის მქონე EWNS-ების რაოდენობა გამოითვალა 7.5 × 104 EWNS/წმ-ად, რაც მსგავსია ადრე გამოქვეყნებული საბაზისო EWNS8-ისა. EPR სპექტრებმა ნათლად აჩვენა ROS-ის ორი ტიპის არსებობა, სადაც O2- დომინანტური სახეობაა და OH• ნაკლებად გავრცელებული. გარდა ამისა, პიკური ინტენსივობების პირდაპირმა შედარებამ აჩვენა, რომ ოპტიმიზებულ EWNS-ს ჰქონდა მნიშვნელოვნად მაღალი ROS შემცველობა საბაზისო EWNS-თან შედარებით.
ნახ. 4-ზე ნაჩვენებია EWNS-ის დეპონირების ეფექტურობა EPES-ში. მონაცემები ასევე შეჯამებულია ცხრილში I და შედარებულია EWNS-ის ორიგინალურ მონაცემებთან. EUNS-ის ორივე შემთხვევაში, დეპონირება თითქმის 100%-ია, თუნდაც 3.0 კვ დაბალი ძაბვის დროს. როგორც წესი, 3.0 კვ საკმარისია 100%-იანი დეპონირებისთვის, ზედაპირის მუხტის ცვლილების მიუხედავად. იმავე პირობებში, Baseline-EWNS-ის დეპონირების ეფექტურობა მხოლოდ 56% იყო მათი დაბალი მუხტის გამო (საშუალოდ 10 ელექტრონი თითო EWNS-ზე).
ნახ. 5-სა და ცხრილ 2-ში შეჯამებულია პომიდვრის ზედაპირზე ინოკულირებული მიკროორგანიზმების ინაქტივაციის მნიშვნელობა დაახლოებით 40,000 #/სმ3 EWNS-ის ზემოქმედების შემდეგ 45 წუთის განმავლობაში ოპტიმალურ რეჟიმში [-6.5 კვ, 4.0 სმ]. ინოკულირებულმა E. coli-მ და Lactobacillus innocuous-მა 45 წუთიანი ზემოქმედების დროს 3.8 ლოგარითმული კლება აჩვენა. იმავე პირობებში, S. enterica-ს 2.2 ლოგარითმული კლება ჰქონდა, ხოლო S. cerevisiae-ს და M. parafortutum-ს 1.0 ლოგარითმული კლება ჰქონდათ.
ელექტრონული მიკროგრაფიები (სურათი 6) ასახავს EWNS-ის მიერ ინდუცირებულ ფიზიკურ ცვლილებებს უვნებელ Escherichia coli-ს, Streptococcus-ის და Lactobacillus-ის უჯრედებზე, რაც იწვევს მათ ინაქტივაციას. საკონტროლო ბაქტერიებს ჰქონდათ დაუზიანებელი უჯრედული მემბრანები, ხოლო ექსპოზიციურ ბაქტერიებს დაზიანებული ჰქონდათ გარეთა მემბრანები.
საკონტროლო და ექსპონირებული ბაქტერიების ელექტრონულ-მიკროსკოპიულმა გამოსახულებამ მემბრანის დაზიანება გამოავლინა.
ოპტიმიზებული EWNS-ის ფიზიკურ-ქიმიური თვისებების შესახებ მონაცემები ერთობლივად აჩვენებს, რომ EWNS-ის თვისებები (ზედაპირული მუხტი და ROS შემცველობა) მნიშვნელოვნად გაუმჯობესდა EWNS-ის ადრე გამოქვეყნებულ საბაზისო მონაცემებთან შედარებით8,9,10,11. მეორეს მხრივ, მათი ზომა ნანომეტრის დიაპაზონში დარჩა, რაც ძალიან ჰგავს ადრე გამოქვეყნებულ შედეგებს, რაც მათ საშუალებას აძლევს, ჰაერში დიდი ხნის განმავლობაში დარჩნენ. დაკვირვებული პოლიდისპერსიულობა შეიძლება აიხსნას ზედაპირული მუხტის ცვლილებებით, რომლებიც განსაზღვრავენ EWNS-ის ზომას, რელეის ეფექტის შემთხვევითობას და პოტენციურ შერწყმას. თუმცა, როგორც ნილსენი და სხვები 22 დეტალურად აღწერენ, მაღალი ზედაპირული მუხტი ამცირებს აორთქლებას წყლის წვეთის ზედაპირული ენერგიის/დაჭიმულობის ეფექტურად გაზრდით. ჩვენს წინა პუბლიკაციაში8 ეს თეორია ექსპერიმენტულად დადასტურდა მიკროწვეთებისა 22 და EWNS-ისთვის. მუხტის დაკარგვამ დროთა განმავლობაში ასევე შეიძლება გავლენა მოახდინოს ზომაზე და წვლილი შეიტანოს დაკვირვებული ზომის განაწილებაში.
გარდა ამისა, სტრუქტურის მუხტი დაახლოებით 22-44 e--ია, სიტუაციიდან გამომდინარე, რაც მნიშვნელოვნად მაღალია ძირითად EWNS-თან შედარებით, რომელსაც სტრუქტურაზე საშუალოდ 10 ± 2 ელექტრონი აქვს. თუმცა, უნდა აღინიშნოს, რომ ეს არის EWNS-ის საშუალო მუხტი. სეტო და სხვ. ნაჩვენებია, რომ მუხტი არაერთგვაროვანია და მიჰყვება ლოგარითმულ-ნორმალურ განაწილებას21. ჩვენს წინა ნაშრომთან შედარებით, ზედაპირული მუხტის გაორმაგება EPES სისტემაში დეპონირების ეფექტურობას თითქმის 100%-მდე აორმაგებს11.