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Kürzlich wurde eine chemikalienfreie antimikrobielle Plattform auf Basis von Nanotechnologie unter Verwendung künstlicher Wassernanostrukturen (EWNS) entwickelt. EWNS weisen eine hohe Oberflächenladung auf und sind mit reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) gesättigt, die mit einer Reihe von Mikroorganismen, darunter auch Lebensmittelpathogene, interagieren und diese inaktivieren können. Hier wird gezeigt, dass ihre Eigenschaften während der Synthese feinabgestimmt und optimiert werden können, um ihr antibakterielles Potenzial weiter zu steigern. Die EWNS-Laborplattform wurde entwickelt, um die Eigenschaften von EWNS durch Variation der Syntheseparameter gezielt einzustellen. Die Charakterisierung der EWNS-Eigenschaften (Ladung, Größe und ROS-Gehalt) erfolgte mittels moderner Analysemethoden. Darüber hinaus wurde ihr mikrobielles Inaktivierungspotenzial gegenüber Lebensmittelpathogenen wie Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum und Saccharomyces cerevisiae untersucht. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass die Eigenschaften von EWNS während der Synthese feinabgestimmt werden können, was zu einer exponentiellen Steigerung der Inaktivierungseffizienz führt. Insbesondere erhöhte sich die Oberflächenladung um das Vierfache und die Menge reaktiver Sauerstoffspezies stieg an. Die mikrobielle Abbaurate war mikrobiell abhängig und lag nach 45-minütiger Exposition gegenüber einer Aerosoldosis von 40.000 #/cm³ EWNS zwischen 1,0 und 3,8 log.
Mikrobielle Kontamination ist die Hauptursache für lebensmittelbedingte Erkrankungen durch die Aufnahme von Krankheitserregern oder deren Toxinen. Allein in den Vereinigten Staaten verursachen lebensmittelbedingte Erkrankungen jährlich etwa 76 Millionen Krankheitsfälle, 325.000 Krankenhausaufenthalte und 5.000 Todesfälle¹. Darüber hinaus schätzt das US-Landwirtschaftsministerium (USDA), dass der gestiegene Konsum von Frischprodukten für 48 % aller gemeldeten lebensmittelbedingten Erkrankungen in den Vereinigten Staaten verantwortlich ist². Die Kosten für Krankheiten und Todesfälle durch lebensmittelbedingte Krankheitserreger in den Vereinigten Staaten sind sehr hoch und werden von den Centers for Disease Control and Prevention (CDC) auf über 15,6 Milliarden US-Dollar pro Jahr geschätzt³.
Derzeit werden chemische⁴, radiologische⁵ und thermische⁶ antimikrobielle Maßnahmen zur Gewährleistung der Lebensmittelsicherheit hauptsächlich an wenigen kritischen Kontrollpunkten (CCPs) entlang der Produktionskette (in der Regel nach der Ernte und/oder während der Verpackung) und nicht kontinuierlich durchgeführt. Daher besteht die Gefahr von Kreuzkontaminationen. 7. Eine bessere Kontrolle von lebensmittelbedingten Erkrankungen und Lebensmittelverderb erfordert antimikrobielle Maßnahmen, die potenziell entlang der gesamten Wertschöpfungskette vom Erzeuger bis zum Verbraucher angewendet werden können und gleichzeitig die Umweltbelastung und die Kosten reduzieren.
Kürzlich wurde eine chemikalienfreie, auf Nanotechnologie basierende antimikrobielle Plattform entwickelt, die mithilfe künstlicher Wassernanostrukturen (EWNS) Bakterien auf Oberflächen und in der Luft inaktivieren kann. EWNS wurden mittels zweier paralleler Prozesse synthetisiert: Elektrospray und Wasserionisation (Abb. 1a). Frühere Studien haben gezeigt, dass EWNS einzigartige physikalische und biologische Eigenschaften aufweisen^8,9,10. EWNS besitzen durchschnittlich 10 Elektronen pro Struktur und eine durchschnittliche Nanogröße von 25 nm (Abb. 1b,c)^8,9,10. Darüber hinaus zeigte die Elektronenspinresonanz (ESR), dass EWNS eine große Menge reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), hauptsächlich Hydroxyl- (OH•) und Superoxid-Radikale (O_2-), enthalten (Abb. 1c)⁸. EWNS verbleiben lange in der Luft und können mit in der Luft suspendierten und auf Oberflächen vorhandenen Mikroorganismen kollidieren, ihre ROS-Ladung abgeben und so die Mikroorganismen inaktivieren (Abb. 1d). Diese frühen Studien zeigten auch, dass EWNS mit verschiedenen gramnegativen und grampositiven Bakterien, einschließlich Mykobakterien, auf Oberflächen und in der Luft interagieren und diese inaktivieren kann. Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen belegten, dass die Inaktivierung durch eine Zerstörung der Zellmembran verursacht wird. Akute Inhalationsstudien ergaben zudem, dass hohe Dosen von EWNS keine Lungenschäden oder Entzündungen hervorrufen.
(a) Elektrospray entsteht durch Anlegen einer Hochspannung zwischen einem mit Flüssigkeit gefüllten Kapillarröhrchen und einer Gegenelektrode. (b) Die Anwendung von hohem Druck führt zu zwei Phänomenen: (i) dem Elektrosprayen von Wasser und (ii) der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (Ionen), die in den elektrosprayten Nanopartikeln (EWNS) eingeschlossen werden. (c) Die einzigartige Struktur der EWNS. (d) Aufgrund ihrer Nanogröße sind EWNS hochmobil und können mit luftgetragenen Krankheitserregern interagieren.
Die Fähigkeit der antimikrobiellen EWNS-Plattform, lebensmittelbedingte Mikroorganismen auf der Oberfläche frischer Lebensmittel zu inaktivieren, wurde kürzlich nachgewiesen. Es konnte gezeigt werden, dass die Oberflächenladung von EWNS in Kombination mit einem elektrischen Feld für eine gezielte Applikation genutzt werden kann. Erste Ergebnisse mit Bio-Tomaten nach 90-minütiger Exposition bei einer EWNS-Konzentration von ca. 50.000 #/cm³ waren vielversprechend. Dabei wurden verschiedene lebensmittelbedingte Mikroorganismen wie E. coli und Listeria 11 nachgewiesen. Vorläufige organoleptische Tests zeigten zudem keine sensorischen Beeinträchtigungen im Vergleich zu Kontrolltomaten. Obwohl diese ersten Inaktivierungsergebnisse für Anwendungen im Bereich der Lebensmittelsicherheit selbst bei sehr niedrigen EWNS-Dosen von 50.000 #/cm³ vielversprechend sind, ist klar, dass ein höheres Inaktivierungspotenzial vorteilhafter wäre, um das Risiko von Infektionen und Verderb weiter zu reduzieren.
Hier konzentrieren wir uns in unserer Forschung auf die Entwicklung einer EWNS-Generierungsplattform, um die Syntheseparameter präzise einzustellen und die physikochemischen Eigenschaften der EWNS zu optimieren und so deren antibakterielles Potenzial zu steigern. Die Optimierung zielt insbesondere auf die Erhöhung der Oberflächenladung (zur Verbesserung der gezielten Wirkstofffreisetzung) und des ROS-Gehalts (zur Steigerung der Inaktivierungseffizienz) ab. Die optimierten physikochemischen Eigenschaften (Größe, Ladung und ROS-Gehalt) werden mithilfe moderner Analysemethoden charakterisiert. Dabei werden häufig vorkommende Lebensmittelmikroorganismen wie E. coli verwendet.
EVNS wurde durch simultane Elektrospray-Ionisation von hochreinem Wasser (18 MΩ cm–1) synthetisiert. Der elektrische Zerstäuber 12 wird typischerweise zur Zerstäubung von Flüssigkeiten und zur Synthese von Polymer- und Keramikpartikeln 13 sowie Fasern 14 mit kontrollierter Größe eingesetzt.
Wie in früheren Veröffentlichungen 8, 9, 10, 11 detailliert beschrieben, wurde in einem typischen Experiment eine Hochspannung zwischen einer Metallkapillare und einer geerdeten Gegenelektrode angelegt. Dabei treten zwei Phänomene auf: i) Elektrospray und ii) Wasserionisation. Ein starkes elektrisches Feld zwischen den beiden Elektroden führt zur Bildung negativer Ladungen auf der Oberfläche des kondensierten Wassers und damit zur Ausbildung von Taylor-Kegeln. Dadurch entstehen hochgeladene Wassertröpfchen, die gemäß der Rayleigh-Theorie 16 weiter in kleinere Partikel zerfallen. Gleichzeitig bewirken starke elektrische Felder die Spaltung einiger Wassermoleküle und die Abgabe von Elektronen (Ionisation), wodurch große Mengen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) 17 entstehen. Die gleichzeitig erzeugten ROS 18 wurden in EWNS (Abb. 1c) eingekapselt.
Abbildung 2a zeigt das in dieser Studie entwickelte und verwendete EWNS-Generierungssystem. Gereinigtes Wasser aus einer geschlossenen Flasche wurde durch einen Teflonschlauch (2 mm Innendurchmesser) in eine 30G-Edelstahlnadel (Metallkapillare) geleitet. Der Wasserfluss wird, wie in Abbildung 2b dargestellt, durch den Luftdruck in der Flasche gesteuert. Die Nadel ist auf einer Teflonkonsole montiert und kann manuell in einem bestimmten Abstand zur Gegenelektrode positioniert werden. Die Gegenelektrode ist eine polierte Aluminiumscheibe mit einer zentralen Öffnung zur Probenahme. Unterhalb der Gegenelektrode befindet sich ein Aluminium-Probenahmetrichter, der über einen Probenahmeanschluss mit dem restlichen Versuchsaufbau verbunden ist (Abb. 2b). Um eine Ladungsansammlung zu vermeiden, die die Funktion des Probenehmers beeinträchtigen könnte, sind alle Komponenten des Probenehmers geerdet.
(a) System zur Erzeugung von Nanostrukturen in technischem Wasser (EWNS). (b) Querschnitt des Probennehmers und des Elektrosprays mit Darstellung der wichtigsten Parameter. (c) Versuchsaufbau zur Bakterieninaktivierung.
Das oben beschriebene EWNS-Erzeugungssystem ermöglicht die Anpassung wichtiger Betriebsparameter zur Feinabstimmung der EWNS-Eigenschaften. Durch Einstellen der angelegten Spannung (V), des Abstands zwischen Nadel und Gegenelektrode (L) sowie des Wasserdurchflusses (φ) durch die Kapillare lassen sich die EWNS-Charakteristiken feinabstimmen. Verschiedene Kombinationen werden durch folgendes Symbol dargestellt: [V (kV), L (cm)]. Der Wasserdurchfluss wird so angepasst, dass ein stabiler Taylor-Kegel mit den entsprechenden Werten [V, L] entsteht. Für diese Studie wurde der Öffnungsdurchmesser der Gegenelektrode (D) auf 0,5 Zoll (1,29 cm) festgelegt.
Aufgrund der eingeschränkten Geometrie und Asymmetrie lässt sich die elektrische Feldstärke nicht aus grundlegenden Prinzipien berechnen. Stattdessen wurde die Software QuickField™ (Svendborg, Dänemark)¹⁹ zur Berechnung des elektrischen Feldes verwendet. Da das elektrische Feld nicht homogen ist, diente der Wert des elektrischen Feldes an der Kapillarspitze als Referenzwert für verschiedene Konfigurationen.
Im Rahmen der Studie wurden verschiedene Kombinationen von Spannung und Abstand zwischen Nadel und Gegenelektrode hinsichtlich der Taylor-Kegel-Bildung, der Taylor-Kegel-Stabilität, der Stabilität der EWNS-Produktion und der Reproduzierbarkeit untersucht. Verschiedene Kombinationen sind in der ergänzenden Tabelle S1 dargestellt.
Der Ausgang des EWNS-Generierungssystems wurde direkt an einen Scanning Mobility Particle Size Analyzer (SMPS, Modell 3936, TSI, Shoreview, MN) zur Messung der Partikelanzahlkonzentration sowie an ein Aerosol-Faraday-Elektrometer (TSI, Modell 3068B, Shoreview, MN) zur Messung der Aerosolströme angeschlossen. Die Messung der Aerosolströme erfolgte wie in unserer vorherigen Publikation beschrieben. Sowohl der SMPS als auch das Aerosol-Elektrometer arbeiteten mit einer Durchflussrate von 0,5 l/min (Gesamtprobendurchfluss 1 l/min). Die Partikelanzahlkonzentration und der Aerosolstrom wurden über 120 Sekunden gemessen. Die Messung wurde 30-mal wiederholt. Basierend auf den Strommessungen wurde die Gesamtladung des Aerosols berechnet und die durchschnittliche EWNS-Ladung für eine gegebene Gesamtzahl ausgewählter EWNS-Partikel abgeschätzt. Die durchschnittlichen Kosten von EWNS können mithilfe von Gleichung (1) berechnet werden.
wobei IEl der gemessene Strom, NSMPS die mit dem SMPS gemessene digitale Konzentration und φEl die Durchflussrate pro Elektrometer ist.
Da die relative Luftfeuchtigkeit (RH) die Oberflächenladung beeinflusst, wurden Temperatur und relative Luftfeuchtigkeit während des Experiments konstant bei 21°C bzw. 45% gehalten.
Zur Messung der Größe und Lebensdauer der EWNS wurde ein Rasterkraftmikroskop (AFM) mit dem Modell Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) und der Sonde AC260T (Olympus, Tokio, Japan) verwendet. Die AFM-Abtastfrequenz betrug 1 Hz, die Abtastfläche 5 μm × 5 μm und es wurden 256 Abtastlinien erfasst. Alle Bilder wurden mit der Asylum-Software einer Bildausrichtung erster Ordnung unterzogen (Maskierungsbereich 100 nm, Schwellenwert 100 pm).
Der Testtrichter wurde entfernt und die Glimmeroberfläche für eine Mittelungszeit von 120 s in einem Abstand von 2,0 cm von der Gegenelektrode positioniert, um Partikelagglomeration und die Bildung unregelmäßiger Tröpfchen auf der Glimmeroberfläche zu vermeiden. EWNS wurde direkt auf die Oberfläche von frisch geschnittenem Glimmer (Ted Pella, Redding, CA) aufgesprüht. Abbildung der Glimmeroberfläche unmittelbar nach dem AFM-Sputtern. Der Kontaktwinkel der Oberfläche von frisch geschnittenem, unmodifiziertem Glimmer liegt nahe bei 0°, sodass sich EWNS kuppelförmig auf der Glimmeroberfläche verteilt. Durchmesser (a) und Höhe (h) der diffundierenden Tröpfchen wurden direkt aus der AFM-Topographie gemessen und zur Berechnung des EWNS-Diffusionsvolumens in Kuppelform mithilfe unserer zuvor validierten Methode verwendet. Unter der Annahme, dass die EWNS-Moleküle an Bord das gleiche Volumen aufweisen, kann der äquivalente Durchmesser mithilfe von Gleichung (2) berechnet werden:
Basierend auf unserer zuvor entwickelten Methode wurde eine Elektronenspinresonanz (ESR)-Spinfalle zur Detektion kurzlebiger Radikalzwischenprodukte in EWNS eingesetzt. Aerosole wurden durch einen 650 μm Midget-Sparger (Ace Glass, Vineland, NJ) geleitet, der eine 235 mM Lösung von DEPMPO (5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrrolin-N-oxid) (Oxis International Inc., Portland, Oregon) enthielt. Alle ESR-Messungen wurden mit einem Bruker EMX-Spektrometer (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, USA) und einer Flachzellenküvette durchgeführt. Die Datenerfassung und -analyse erfolgte mit der Software Acquisit (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, USA). Die Bestimmung der ROS-Charakteristika erfolgte nur für einen Satz von Betriebsbedingungen [-6,5 kV, 4,0 cm]. Die EWNS-Konzentrationen wurden mit dem SMPS nach Berücksichtigung der EWNS-Verluste im Impaktor gemessen.
Die Ozonwerte wurden mit einem 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10 überwacht.
Für alle EWNS-Eigenschaften wird der Mittelwert als Messwert und die Standardabweichung als Messfehler verwendet. Es wurden T-Tests durchgeführt, um die Werte der optimierten EWNS-Attribute mit den entsprechenden Werten des Basis-EWNS zu vergleichen.
Abbildung 2c zeigt ein zuvor entwickeltes und charakterisiertes elektrostatisches Abscheidungssystem (EPES), das zur gezielten Applikation von EWNS auf Oberflächen eingesetzt werden kann. EPES nutzt EVNS-Ladungen, die unter dem Einfluss eines starken elektrischen Feldes direkt zur Zieloberfläche geleitet werden können. Details zum EPES-System sind in einer kürzlich erschienenen Publikation von Pyrgiotakis et al.¹¹ beschrieben. EPES besteht aus einer 3D-gedruckten PVC-Kammer mit konischen Enden und zwei parallelen Edelstahlplatten (304, spiegelbeschichtet) im Abstand von 15,24 cm. Die Platten sind an eine externe Hochspannungsquelle (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY) angeschlossen. Die untere Platte ist stets mit positiver Spannung, die obere Platte stets mit Masse (Potentialanschluss) verbunden. Die Kammerwände sind mit geerdeter Aluminiumfolie ausgekleidet, um Partikelverluste zu vermeiden. Die Kammer verfügt über eine abgedichtete Frontladeklappe, die es ermöglicht, Testoberflächen auf Kunststoffständern zu platzieren, welche sie über die untere Metallplatte anheben, um Hochspannungsstörungen zu vermeiden.
Die Abscheidungseffizienz von EWNS in EPES wurde gemäß einem zuvor entwickelten Protokoll berechnet, das in der ergänzenden Abbildung S111 detailliert beschrieben ist.
Als Kontrollkammer wurde eine zweite zylindrische Durchflusskammer in Reihe mit dem EPES-System geschaltet. In dieser Kammer diente ein HEPA-Zwischenfilter zur Entfernung von EWNS. Wie in Abbildung 2c dargestellt, wurde das EWNS-Aerosol durch zwei integrierte Kammern gepumpt. Der Filter zwischen Kontrollraum und EPES entfernt verbleibendes EWNS, sodass Temperatur (T), relative Luftfeuchtigkeit (RH) und Ozonwerte konstant bleiben.
Wichtige lebensmittelbedingte Mikroorganismen wurden als Kontaminanten in frischen Lebensmitteln identifiziert, darunter E. coli (ATCC #27325), ein Fäkalindikator, Salmonella enterica (ATCC #53647), ein lebensmittelbedingter Krankheitserreger, Listeria harmless (ATCC #33090), ein Surrogat für den pathogenen Erreger Listeria monocytogenes, gewonnen von ATCC (Manassas, VA), Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), ein Ersatz für Verderbnishefe, und ein resistenteres inaktiviertes Bakterium, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Kaufen Sie zufällig ausgewählte Kisten mit Bio-Cherrytomaten auf Ihrem lokalen Markt und lagern Sie diese bis zum Gebrauch (maximal 3 Tage) bei 4 °C im Kühlschrank. Die Testtomaten hatten alle die gleiche Größe, etwa 1,25 cm im Durchmesser.
Die Protokolle für Kultur, Inokulation, Exposition und Koloniezählung sind in unserer vorherigen Publikation und in den ergänzenden Daten detailliert beschrieben. Die Wirksamkeit von EWNS wurde durch Exposition inokulierter Tomaten gegenüber 40.000 Keimen/cm³ für 45 Minuten evaluiert. Kurz gesagt, wurden drei Tomaten verwendet, um die überlebenden Mikroorganismen zum Zeitpunkt t = 0 min zu bestimmen. Drei Tomaten wurden in EPES platziert und EWNS mit 40.000 Keimen/cm³ ausgesetzt (EWNS-exponierte Tomaten), die restlichen drei in die Kontrollkammer (Kontrolltomaten). Die Tomaten beider Gruppen wurden nicht weiterverarbeitet. EWNS-exponierte und Kontrolltomaten wurden nach 45 Minuten entnommen, um die Wirkung von EWNS zu beurteilen.
Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt. Die Datenanalyse erfolgte gemäß dem in den ergänzenden Daten beschriebenen Protokoll.
Die Inaktivierungsmechanismen wurden durch Sedimentation exponierter EWNS-Proben (45 min bei einer EWNS-Aerosolkonzentration von 40.000 Partikeln/cm³) und nicht bestrahlter Proben harmloser Bakterien (E. coli, Salmonella enterica und Lactobacillus) untersucht. Die Partikel wurden in 2,5 % Glutaraldehyd, 1,25 % Paraformaldehyd und 0,03 % Pikrinsäure in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (pH 7,4) für 2 Stunden bei Raumtemperatur fixiert. Nach dem Waschen erfolgte eine Nachfixierung mit 1 % Osmiumtetroxid (OsO₄)/1,5 % Kaliumhexacyanoferrat(II) (KFeCN₆) für 2 Stunden, dreimaliges Waschen mit Wasser und Inkubation in 1 % Uranylacetat für 1 Stunde. Anschließend wurden die Proben zweimal mit Wasser gewaschen und schließlich in 50 %, 70 %, 90 % und 100 %igem Alkohol für jeweils 10 Minuten dehydriert. Die Proben wurden anschließend 1 Stunde lang in Propylenoxid gelagert und mit einem 1:1-Gemisch aus Propylenoxid und TAAP Epon (Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA, USA) imprägniert. Die Proben wurden in TAAB Epon eingebettet und 48 Stunden lang bei 60 °C polymerisiert. Das ausgehärtete Granulat wurde geschnitten und mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) mit einem konventionellen JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japan), ausgestattet mit einer AMT 2k CCD-Kamera (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, USA), visualisiert.
Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Für jeden Messzeitpunkt wurden Bakterienwaschungen dreifach beimpft, sodass insgesamt neun Datenpunkte pro Messpunkt vorlagen. Der Mittelwert dieser Datenpunkte wurde als Bakterienkonzentration für den jeweiligen Mikroorganismus verwendet. Die Standardabweichung diente als Messfehler. Alle Messwerte wurden berücksichtigt.
Der Logarithmus der Abnahme der Bakterienkonzentration im Vergleich zu t = 0 min wurde mit folgender Formel berechnet:
wobei C0 die Bakterienkonzentration in der Kontrollprobe zum Zeitpunkt 0 (d. h. nachdem die Oberfläche getrocknet ist, aber bevor sie in die Kammer gestellt wird) und Cn die Bakterienkonzentration auf der Oberfläche nach n Minuten Exposition ist.
Um dem natürlichen Abbau der Bakterien während der 45-minütigen Exposition Rechnung zu tragen, wurde die logarithmische Reduktion im Vergleich zur Kontrolle nach 45 Minuten wie folgt berechnet:
Dabei ist Cn die Bakterienkonzentration in der Kontrollprobe zum Zeitpunkt n und Cn-Kontrolle die Konzentration der Kontrollbakterien zum Zeitpunkt n. Die Daten werden als logarithmische Reduktion im Vergleich zur Kontrolle (keine EWNS-Exposition) dargestellt.
Im Rahmen der Studie wurden verschiedene Kombinationen von Spannung und Abstand zwischen Nadel und Gegenelektrode hinsichtlich der Taylor-Kegel-Bildung, der Taylor-Kegel-Stabilität, der Stabilität der EWNS-Produktion und der Reproduzierbarkeit untersucht. Verschiedene Kombinationen sind in Tabelle S1 (Anhang) dargestellt. Zwei Fälle mit stabilen und reproduzierbaren Eigenschaften (Taylor-Kegel, EWNS-Bildung und zeitliche Stabilität) wurden für eine umfassende Untersuchung ausgewählt. Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse für Ladung, Größe und ROS-Gehalt in beiden Fällen. Die Ergebnisse sind auch in Tabelle 1 zusammengefasst. Zum Vergleich sind in Abbildung 3 und Tabelle 1 die Eigenschaften der zuvor synthetisierten, nicht optimierten EWNS^8,9,10,11 (Baseline-EWNS) aufgeführt. Die Berechnungen zur statistischen Signifikanz mittels zweiseitigem t-Test sind in Tabelle S2 (Anhang) erneut veröffentlicht. Zusätzlich umfassen die Daten Untersuchungen zum Einfluss des Durchmessers (D) der Probenahmeöffnung der Gegenelektrode und des Abstands (L) zwischen Erdungselektrode und Spitze (Abbildungen S2 und S3 im Anhang).
(ac) Größenverteilung, gemessen mittels AFM. (df) Oberflächenladungscharakteristik. (g) ROS-Charakterisierung mittels EPR.
Es ist außerdem wichtig zu erwähnen, dass unter allen oben genannten Bedingungen der gemessene Ionisationsstrom zwischen 2 und 6 μA und die Spannung zwischen -3,8 und -6,5 kV lag, was zu einer Leistungsaufnahme von weniger als 50 mW für dieses einzelne EWNS-Generierungskontaktmodul führte. Obwohl EWNS unter hohem Druck synthetisiert wurde, waren die Ozonwerte sehr niedrig und überschritten nie 60 ppb.
Abbildung S4 im Anhang zeigt die simulierten elektrischen Felder für die Szenarien [-6,5 kV, 4,0 cm] und [-3,8 kV, 0,5 cm]. Die berechneten Feldstärken betragen 2 × 10⁵ V/m bzw. 4,7 × 10⁵ V/m. Dies ist zu erwarten, da im zweiten Fall das Verhältnis von Spannung zu Abstand deutlich höher ist.
Abbildung 3a,b zeigt den mit dem AFM8 gemessenen EWNS-Durchmesser. Die berechneten mittleren EWNS-Durchmesser betrugen 27 nm bzw. 19 nm für die Messschemata [-6,5 kV, 4,0 cm] bzw. [-3,8 kV, 0,5 cm]. Für die Szenarien [-6,5 kV, 4,0 cm] und [-3,8 kV, 0,5 cm] lagen die geometrischen Standardabweichungen der Verteilungen bei 1,41 bzw. 1,45, was auf eine enge Größenverteilung hindeutet. Sowohl die mittlere Größe als auch die geometrische Standardabweichung liegen mit 25 nm bzw. 1,41 sehr nahe am Wert des Referenz-EWNS. Abbildung 3c zeigt die Größenverteilung des Referenz-EWNS, gemessen mit derselben Methode unter denselben Bedingungen.
Abbildung 3d,e zeigt die Ergebnisse der Ladungscharakterisierung. Die Daten stellen Mittelwerte aus 30 simultanen Messungen der Konzentration (#/cm³) und des Stroms (I) dar. Die Analyse zeigt, dass die mittlere Ladung auf den EWNS 22 ± 6 e⁻ bzw. 44 ± 6 e⁻ für [-6,5 kV, 4,0 cm] bzw. [-3,8 kV, 0,5 cm] beträgt. Sie weisen deutlich höhere Oberflächenladungen auf als die der Basis-EWNS (10 ± 2 e⁻), sind doppelt so hoch wie im Szenario [-6,5 kV, 4,0 cm] und viermal so hoch wie im Szenario [-3,8 kV, 0,5 cm]. Abbildung 3f zeigt die Ladungsdaten für die Basis-EWNS.
Aus den Konzentrationskarten der EWNS-Anzahl (Abbildungen S5 und S6 im Anhang) geht hervor, dass im Szenario [-6,5 kV, 4,0 cm] deutlich mehr Partikel auftreten als im Szenario [-3,8 kV, 0,5 cm]. Es ist außerdem anzumerken, dass die EWNS-Anzahlkonzentration über einen Zeitraum von bis zu vier Stunden überwacht wurde (Abbildungen S5 und S6 im Anhang). Die Stabilität der EWNS-Erzeugung zeigte dabei in beiden Fällen ein gleichbleibendes Niveau der Partikelanzahlkonzentration.
Abbildung 3g zeigt das EPR-Spektrum nach Subtraktion des optimierten EWNS-Kontrollspektrums (Hintergrund) bei [-6,5 kV, 4,0 cm]. Die ROS-Spektren wurden zudem mit dem Baseline-EWNS-Szenario einer zuvor veröffentlichten Arbeit verglichen. Die Anzahl der mit Spinfallen reagierenden EWNS wurde mit 7,5 × 10⁴ EWNS/s berechnet, was dem Wert des zuvor veröffentlichten Baseline-EWNS⁸ entspricht. Die EPR-Spektren zeigten deutlich das Vorhandensein zweier ROS-Arten, wobei O₂⁻ die vorherrschende Spezies und OH• in geringerer Menge vorkam. Ein direkter Vergleich der Peakintensitäten ergab darüber hinaus, dass das optimierte EWNS einen signifikant höheren ROS-Gehalt aufwies als das Baseline-EWNS.
Abbildung 4 zeigt die Abscheidungseffizienz von EWNS in EPES. Die Daten sind auch in Tabelle I zusammengefasst und mit den ursprünglichen EWNS-Daten verglichen. In beiden Fällen von EUNS liegt die Abscheidung selbst bei einer niedrigen Spannung von 3,0 kV nahe 100 %. Typischerweise reichen 3,0 kV für eine 100%ige Abscheidung aus, unabhängig von der Änderung der Oberflächenladung. Unter denselben Bedingungen betrug die Abscheidungseffizienz von Baseline-EWNS aufgrund ihrer geringeren Ladung (durchschnittlich 10 Elektronen pro EWNS) nur 56 %.
Abbildung 5 und Tabelle 2 fassen die Inaktivierungswerte von Mikroorganismen zusammen, die auf die Oberfläche von Tomaten aufgebracht wurden, nach einer 45-minütigen Exposition gegenüber ca. 40.000 #/cm³ EWNS im optimalen Modus [-6,5 kV, 4,0 cm]. Die aufgebrachten E. coli und Lactobacillus innocuous zeigten eine signifikante Reduktion um 3,8 log-Stufen während der 45-minütigen Exposition. Unter denselben Bedingungen wurde bei S. enterica eine Reduktion um 2,2 log-Stufen beobachtet, während S. cerevisiae und M. parafortutum eine Reduktion um 1,0 log-Stufe aufwiesen.
Die Elektronenmikroskopaufnahmen (Abbildung 6) zeigen die durch EWNS hervorgerufenen physikalischen Veränderungen an harmlosen Escherichia coli-, Streptococcus- und Lactobacillus-Zellen, die zu deren Inaktivierung führen. Die Kontrollbakterien wiesen intakte Zellmembranen auf, während die exponierten Bakterien beschädigte äußere Membranen zeigten.
Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Kontroll- und exponierten Bakterien zeigten Membranschäden.
Die Daten zu den physikochemischen Eigenschaften der optimierten EWNS zeigen insgesamt, dass die Eigenschaften (Oberflächenladung und ROS-Gehalt) der EWNS im Vergleich zu den zuvor veröffentlichten EWNS-Basisdaten^8,9,10,11 signifikant verbessert wurden. Andererseits blieb ihre Größe im Nanometerbereich, sehr ähnlich den zuvor berichteten Ergebnissen, wodurch sie über längere Zeiträume in der Luft verbleiben können. Die beobachtete Polydispersität lässt sich durch Änderungen der Oberflächenladung, die die Größe der EWNS bestimmen, die Zufälligkeit des Rayleigh-Effekts und mögliche Koaleszenz erklären. Wie Nielsen et al.²² jedoch detailliert beschrieben haben, reduziert eine hohe Oberflächenladung die Verdunstung, indem sie die Oberflächenenergie/-spannung des Wassertropfens effektiv erhöht. In unserer vorherigen Publikation⁸ wurde diese Theorie experimentell für Mikrotröpfchen²² und EWNS bestätigt. Der Ladungsverlust im Laufe der Zeit kann ebenfalls die Größe beeinflussen und zur beobachteten Größenverteilung beitragen.
Darüber hinaus beträgt die Ladung pro Struktur je nach Situation etwa 22–44 e⁻, was deutlich höher ist als bei den Basis-EWNS mit einer durchschnittlichen Ladung von 10 ± 2 Elektronen pro Struktur. Es ist jedoch zu beachten, dass dies die durchschnittliche Ladung der EWNS ist. Seto et al. haben gezeigt, dass die Ladung inhomogen ist und einer logarithmischen Normalverteilung folgt.²¹ Im Vergleich zu unserer vorherigen Arbeit verdoppelt eine Verdopplung der Oberflächenladung die Abscheidungseffizienz im EPES-System auf nahezu 100 %.¹¹