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Recentemente, foi desenvolvida uma plataforma antimicrobiana livre de químicos, baseada em nanotecnologia e utilizando nanoestruturas artificiais de água (EWNS). As EWNS possuem alta carga superficial e são saturadas com espécies reativas de oxigênio (ROS) que podem interagir e inativar diversos microrganismos, incluindo patógenos transmitidos por alimentos. Neste trabalho, demonstra-se que suas propriedades durante a síntese podem ser ajustadas e otimizadas para aumentar ainda mais seu potencial antibacteriano. A plataforma laboratorial de EWNS foi projetada para ajustar as propriedades das EWNS por meio da alteração dos parâmetros de síntese. A caracterização das propriedades das EWNS (carga, tamanho e conteúdo de ROS) foi realizada utilizando métodos analíticos modernos. Além disso, avaliou-se seu potencial de inativação microbiana contra microrganismos transmitidos por alimentos, como Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuus, Mycobacterium paraaccidentum e Saccharomyces cerevisiae. Os resultados apresentados demonstram que as propriedades das EWNS podem ser ajustadas durante a síntese, resultando em um aumento exponencial na eficiência de inativação. Em particular, a carga superficial aumentou quatro vezes e as espécies reativas de oxigênio também aumentaram. A taxa de remoção microbiana foi dependente do microrganismo e variou de 1,0 a 3,8 log após 45 minutos de exposição a uma dose de aerossol de 40.000 #/cc de EWNS.
A contaminação microbiana é a principal causa de doenças transmitidas por alimentos, resultantes da ingestão de patógenos ou suas toxinas. Somente nos Estados Unidos, essas doenças causam cerca de 76 milhões de casos, 325 mil internações hospitalares e 5 mil mortes por ano¹. Além disso, o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) estima que o aumento do consumo de produtos frescos seja responsável por 48% de todos os casos de doenças transmitidas por alimentos relatados nos Estados Unidos². O custo das doenças e mortes causadas por patógenos transmitidos por alimentos nos Estados Unidos é muito alto, estimado pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) em mais de US$ 15,6 bilhões por ano³.
Atualmente, as intervenções antimicrobianas químicas4, por radiação5 e térmicas6 para garantir a segurança alimentar são realizadas principalmente em pontos críticos de controle (PCCs) limitados ao longo da cadeia de produção (geralmente após a colheita e/ou durante o envase), em vez de serem aplicadas continuamente. Assim, estão sujeitas à contaminação cruzada. 7. Um melhor controle de doenças transmitidas por alimentos e da deterioração dos alimentos requer intervenções antimicrobianas que possam ser aplicadas em toda a cadeia produtiva, do campo à mesa, reduzindo o impacto ambiental e os custos.
Recentemente, foi desenvolvida uma plataforma antimicrobiana livre de químicos, baseada em nanotecnologia, capaz de inativar bactérias presentes em superfícies e no ar, utilizando nanoestruturas artificiais de água (EWNS). As EWNS foram sintetizadas por meio de dois processos paralelos: eletroaspiração e ionização da água (Fig. 1a). Estudos anteriores demonstraram que as EWNS possuem um conjunto único de propriedades físicas e biológicas^8,9,10. As EWNS apresentam, em média, 10 elétrons por estrutura e um tamanho médio em nanoescala de 25 nm (Fig. 1b,c)^8,9,10. Além disso, a ressonância de spin eletrônico (RSE) mostrou que as EWNS contêm uma grande quantidade de espécies reativas de oxigênio (EROs), principalmente radicais hidroxila (OH•) e superóxido (O_2-) (Fig. 1c)⁸. As EWNS permanecem no ar por um longo período e podem colidir com microrganismos suspensos no ar e presentes em superfícies, liberando suas EROs e causando a inativação desses microrganismos (Fig. 1d). Esses estudos iniciais também mostraram que o EWNS pode interagir e inativar várias bactérias gram-negativas e gram-positivas, incluindo micobactérias, em superfícies e no ar. A microscopia eletrônica de transmissão mostrou que a inativação foi causada pela ruptura da membrana celular. Além disso, estudos de inalação aguda mostraram que altas doses de EWNS não causam danos ou inflamação pulmonar 8 .
(a) A eletropulverização ocorre quando uma alta voltagem é aplicada entre um tubo capilar contendo líquido e um contraeletrodo. (b) A aplicação de alta pressão resulta em dois fenômenos diferentes: (i) eletropulverização de água e (ii) formação de espécies reativas de oxigênio (íons) aprisionadas nas EWNS. (c) A estrutura única das EWNS. (d) Devido à sua natureza nanométrica, as EWNS são altamente móveis e podem interagir com patógenos presentes no ar.
A capacidade da plataforma antimicrobiana EWNS de inativar microrganismos transmitidos por alimentos na superfície de alimentos frescos também foi demonstrada recentemente. Foi demonstrado ainda que a carga superficial das EWNS, em combinação com um campo elétrico, pode ser utilizada para atingir níveis de liberação direcionados. Além disso, resultados preliminares obtidos com tomates orgânicos após 90 minutos de exposição a uma concentração de EWNS de aproximadamente 50.000 #/cm³ foram promissores, com a observação de diversos microrganismos transmitidos por alimentos, como *E. coli* e *Listeria 11*. Ademais, testes organolépticos preliminares não apresentaram alterações sensoriais em comparação com os tomates do grupo controle. Embora esses resultados iniciais de inativação sejam promissores para aplicações em segurança alimentar, mesmo com doses muito baixas de EWNS (50.000 #/cm³), é evidente que um potencial de inativação mais elevado seria mais benéfico para reduzir ainda mais o risco de infecção e deterioração.
Aqui, concentraremos nossa pesquisa no desenvolvimento de uma plataforma de geração de EWNS (nanopartículas extracelulares de nanotubos de carbono) para permitir o ajuste fino dos parâmetros de síntese e a otimização das propriedades físico-químicas das EWNS, visando aprimorar seu potencial antibacteriano. Em particular, a otimização tem se concentrado no aumento da carga superficial (para melhorar a entrega direcionada) e do conteúdo de ROS (espécies reativas de oxigênio) (para melhorar a eficiência de inativação). Caracterizaremos as propriedades físico-químicas otimizadas (tamanho, carga e conteúdo de ROS) utilizando métodos analíticos modernos e microrganismos comuns em alimentos, como E. coli.
O EVNS foi sintetizado por eletropulverização e ionização simultâneas de água de alta pureza (18 MΩ cm–1). O nebulizador elétrico 12 é tipicamente usado para a atomização de líquidos e a síntese de partículas de polímero e cerâmica 13 e fibras 14 de tamanho controlado.
Conforme detalhado em publicações anteriores 8, 9, 10, 11, em um experimento típico, uma alta voltagem foi aplicada entre um capilar metálico e um contraeletrodo aterrado. Durante esse processo, dois fenômenos distintos ocorrem: i) eletrodispersão e ii) ionização da água. Um forte campo elétrico entre os dois eletrodos provoca o acúmulo de cargas negativas na superfície da água condensada, resultando na formação de cones de Taylor. Como resultado, formam-se gotículas de água altamente carregadas, que continuam a se fragmentar em partículas menores, conforme a teoria de Rayleigh16. Simultaneamente, campos elétricos intensos provocam a divisão de algumas moléculas de água, liberando elétrons (ionizando-as), o que leva à formação de uma grande quantidade de espécies reativas de oxigênio (ROS)17. As ROS geradas simultaneamente18 foram encapsuladas em EWNS (Fig. 1c).
A Figura 2a mostra o sistema de geração de EWNS desenvolvido e utilizado na síntese de EWNS neste estudo. Água purificada, armazenada em um frasco fechado, foi conduzida através de um tubo de Teflon (2 mm de diâmetro interno) até uma agulha de aço inoxidável 30G (capilar metálico). O fluxo de água é controlado pela pressão do ar dentro do frasco, como mostrado na Figura 2b. A agulha é montada em um suporte de Teflon e pode ser ajustada manualmente a uma determinada distância do contraeletrodo. O contraeletrodo é um disco de alumínio polido com um orifício no centro para amostragem. Abaixo do contraeletrodo encontra-se um funil de amostragem de alumínio, que é conectado ao restante da configuração experimental através de uma porta de amostragem (Figura 2b). Para evitar o acúmulo de carga que possa interromper a operação do amostrador, todos os componentes do amostrador são aterrados eletricamente.
(a) Sistema de Geração de Nanoestruturas de Água Projetadas (EWNS). (b) Corte transversal do amostrador e do eletrospray, mostrando os parâmetros mais importantes. (c) Configuração experimental para inativação de bactérias.
O sistema de geração de EWNS descrito acima permite a alteração de parâmetros operacionais chave para facilitar o ajuste fino das propriedades do EWNS. Ajuste a tensão aplicada (V), a distância entre a agulha e o contraeletrodo (L) e o fluxo de água (φ) através do capilar para refinar as características do EWNS. Símbolo usado para representar diferentes combinações: [V (kV), L (cm)]. Ajuste o fluxo de água para obter um cone de Taylor estável com um determinado conjunto de [V, L]. Para os propósitos deste estudo, o diâmetro da abertura do contraeletrodo (D) foi mantido em 0,5 polegadas (1,29 cm).
Devido à geometria limitada e à assimetria, a intensidade do campo elétrico não pode ser calculada a partir de princípios fundamentais. Em vez disso, o software QuickField™ (Svendborg, Dinamarca)¹⁹ foi utilizado para calcular o campo elétrico. O campo elétrico não é uniforme, portanto, o valor do campo elétrico na ponta do capilar foi usado como valor de referência para várias configurações.
Durante o estudo, diversas combinações de voltagem e distância entre a agulha e o contraeletrodo foram avaliadas em termos de formação do cone de Taylor, estabilidade do cone de Taylor, estabilidade da produção de EWNS e reprodutibilidade. Várias combinações são mostradas na Tabela Suplementar S1.
A saída do sistema de geração EWNS foi conectada diretamente a um Analisador de Tamanho de Partículas por Mobilidade de Varredura (SMPS, Modelo 3936, TSI, Shoreview, MN) para medição da concentração numérica de partículas, bem como a um Eletrômetro Faraday de Aerossol (TSI, Modelo 3068B, Shoreview, MN). A corrente de aerossol foi medida conforme descrito em nossa publicação anterior. Tanto o SMPS quanto o eletrômetro de aerossol amostraram a uma vazão de 0,5 L/min (vazão total da amostra de 1 L/min). A concentração numérica de partículas e a vazão de aerossol foram medidas durante 120 segundos. A medição foi repetida 30 vezes. Com base nas medições de corrente, a carga total de aerossol foi calculada e a carga média do EWNS foi estimada para um determinado número total de partículas EWNS selecionadas. O custo médio do EWNS pode ser calculado usando a Equação (1):
onde IEl é a corrente medida, NSMPS é a concentração digital medida com a SMPS e φEl é a taxa de fluxo por eletrômetro.
Como a umidade relativa (UR) afeta a carga superficial, a temperatura e a UR foram mantidas constantes durante o experimento em 21°C e 45%, respectivamente.
A microscopia de força atômica (AFM), utilizando um microscópio Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) e uma sonda AC260T (Olympus, Tóquio, Japão), foi empregada para medir o tamanho e a vida útil das nanopartículas de parede simples (EWNS). A frequência de varredura da AFM foi de 1 Hz, a área de varredura foi de 5 μm × 5 μm e foram utilizadas 256 linhas de varredura. Todas as imagens foram submetidas a um alinhamento de primeira ordem utilizando o software Asylum (faixa da máscara de 100 nm, limiar de 100 pm).
O funil de teste foi removido e a superfície de mica foi posicionada a uma distância de 2,0 cm do contraeletrodo por um tempo médio de 120 s para evitar a aglomeração de partículas e a formação de gotículas irregulares na superfície da mica. O EWNS foi pulverizado diretamente sobre a superfície da mica recém-cortada (Ted Pella, Redding, CA). Imagem da superfície da mica imediatamente após a pulverização por AFM. O ângulo de contato da superfície da mica recém-cortada e não modificada é próximo de 0°, portanto o EWNS se distribui sobre a superfície da mica na forma de uma cúpula. O diâmetro (a) e a altura (h) das gotículas em difusão foram medidos diretamente a partir da topografia AFM e usados ​​para calcular o volume de difusão da cúpula de EWNS usando nosso método previamente validado. Assumindo que o EWNS embarcado tenha o mesmo volume, o diâmetro equivalente pode ser calculado usando a Equação (2):
Com base em nosso método previamente desenvolvido, um dispositivo de captura de radicais por ressonância de spin eletrônico (RSE) foi utilizado para detectar a presença de intermediários radicais de curta duração em EWNS. Os aerossóis foram borbulhados através de um borbulhador Midget de 650 μm (Ace Glass, Vineland, NJ) contendo uma solução de 235 mM de DEPMPO (5-(dietoxifosforil)-5-metil-1-pirrolina-N-óxido) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Todas as medições de RSE foram realizadas utilizando um espectrômetro Bruker EMX (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, EUA) e uma célula de painel plano. O software Acquisit (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, EUA) foi utilizado para coletar e analisar os dados. A determinação das características das ROS foi realizada apenas para um conjunto de condições operacionais [-6,5 kV, 4,0 cm]. As concentrações de EWNS foram medidas utilizando o SMPS após contabilizar as perdas de EWNS no impactor.
Os níveis de ozono foram monitorizados utilizando um monitor de ozono de feixe duplo 205™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Para todas as propriedades do EWNS, o valor médio é usado como valor de medição e o desvio padrão como erro de medição. Testes t foram realizados para comparar os valores dos atributos do EWNS otimizado com os valores correspondentes do EWNS base.
A Figura 2c mostra um sistema de precipitação eletrostática (EPES) previamente desenvolvido e caracterizado, que pode ser usado para a entrega direcionada de EWNS na superfície. O EPES utiliza cargas de EVNS que podem ser “guiadas” diretamente para a superfície do alvo sob a influência de um forte campo elétrico. Detalhes do sistema EPES são apresentados em uma publicação recente de Pyrgiotakis et al.¹¹ Assim, o EPES consiste em uma câmara de PVC impressa em 3D com extremidades afiladas e contém duas placas metálicas paralelas de aço inoxidável (aço inoxidável 304, com revestimento espelhado) no centro, separadas por 15,24 cm. As placas foram conectadas a uma fonte externa de alta tensão (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), sendo a placa inferior sempre conectada à tensão positiva e a placa superior sempre conectada ao terra (terra flutuante). As paredes da câmara são revestidas com folha de alumínio, que é aterrada eletricamente para evitar a perda de partículas. A câmara possui uma porta frontal selada que permite que as superfícies de teste sejam colocadas em suportes de plástico que as elevam acima da placa metálica inferior para evitar interferências de alta tensão.
A eficiência de deposição de EWNS em EPES foi calculada de acordo com um protocolo previamente desenvolvido, detalhado na Figura Suplementar S111.
Como câmara de controle, uma segunda câmara de fluxo cilíndrica foi conectada em série ao sistema EPES, na qual um filtro HEPA intermediário foi utilizado para remover as EWNS. Conforme mostrado na Figura 2c, o aerossol de EWNS foi bombeado através de duas câmaras integradas. O filtro entre a sala de controle e o EPES remove quaisquer EWNS remanescentes, resultando nos mesmos níveis de temperatura (T), umidade relativa (UR) e ozônio.
Microorganismos importantes transmitidos por alimentos foram encontrados contaminando alimentos frescos, como E. coli (ATCC nº 27325), indicador fecal, Salmonella enterica (ATCC nº 53647), patógeno transmitido por alimentos, Listeria inofensiva (ATCC nº 33090), substituto da Listeria monocytogenes patogênica, derivada de Saccharomyces cerevisiae (ATCC nº 4098) da ATCC (Manassas, VA), um substituto para levedura deteriorante, e uma bactéria inativada mais resistente, Mycobacterium paralucky (ATCC nº 19686).
Compre caixas aleatórias de tomates-cereja orgânicos no mercado local e mantenha-os refrigerados a 4°C até o uso (por até 3 dias). Os tomates usados ​​no experimento tinham todos o mesmo tamanho, cerca de 1,2 cm de diâmetro.
Os protocolos de cultura, inoculação, exposição e contagem de colônias estão detalhados em nossa publicação anterior e nos Dados Suplementares. A eficácia do EWNS foi avaliada expondo tomates inoculados a 40.000 #/cm³ por 45 minutos. Resumidamente, três tomates foram utilizados para avaliar os microrganismos sobreviventes no tempo t = 0 min. Três tomates foram colocados em EPES e expostos ao EWNS a 40.000 #/cm³ (tomates expostos ao EWNS) e os três restantes foram colocados na câmara de controle (tomates controle). Nenhum processamento adicional foi realizado nos tomates de ambos os grupos. Os tomates expostos ao EWNS e os tomates controle foram removidos após 45 minutos para avaliar o efeito do EWNS.
Cada experimento foi realizado em triplicata. A análise dos dados foi realizada de acordo com o protocolo descrito nos Dados Suplementares.
Os mecanismos de inativação foram avaliados por sedimentação de amostras de EWNS expostas (45 min a uma concentração de aerossol de EWNS de 40.000 #/cm³) e amostras não irradiadas de bactérias inofensivas E. coli, Salmonella enterica e Lactobacillus. As partículas foram fixadas em glutaraldeído a 2,5%, paraformaldeído a 1,25% e ácido pícrico a 0,03% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,4) durante 2 horas à temperatura ambiente. Após lavagem, foram pós-fixadas com tetróxido de ósmio (OsO₄) a 1%/ferrocianeto de potássio (KFeCN) a 1,5% durante 2 horas, lavadas 3 vezes em água e incubadas em acetato de uranila a 1% durante 1 hora, lavadas duas vezes em água e desidratadas durante 10 minutos em álcool a 50%, 70%, 90% e 100%. As amostras foram então colocadas em óxido de propileno por 1 hora e impregnadas com uma mistura 1:1 de óxido de propileno e TAAP Epon (Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA). As amostras foram embutidas em TAAB Epon e polimerizadas a 60 °C por 48 horas. A resina granular curada foi cortada e visualizada por MET (Microscopia Eletrônica de Transmissão) utilizando um microscópio eletrônico de transmissão convencional JEOL 1200EX (JEOL, Tóquio, Japão) equipado com uma câmera CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, EUA).
Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Para cada ponto de tempo, as lavagens bacterianas foram semeadas em triplicata, resultando em um total de nove pontos de dados por ponto, cuja média foi usada como a concentração bacteriana para aquele microrganismo específico. O desvio padrão foi usado como erro de medição. Todos os pontos são contabilizados.
O logaritmo da diminuição na concentração de bactérias em comparação com t = 0 min foi calculado usando a seguinte fórmula:
onde C0 é a concentração de bactérias na amostra de controle no tempo 0 (ou seja, após a superfície secar, mas antes de ser colocada na câmara) e Cn é a concentração de bactérias na superfície após n minutos de exposição.
Para levar em consideração a degradação natural das bactérias durante a exposição de 45 minutos, a redução logarítmica em comparação com o controle após 45 minutos também foi calculada da seguinte forma:
onde Cn é a concentração de bactérias na amostra de controle no tempo n e Cn-Controle é a concentração de bactérias de controle no tempo n. Os dados são apresentados como uma redução logarítmica em comparação com o controle (sem exposição ao EWNS).
Durante o estudo, diversas combinações de voltagem e distância entre a agulha e o contraeletrodo foram avaliadas em termos de formação do cone de Taylor, estabilidade do cone de Taylor, estabilidade da produção de EWNS e reprodutibilidade. Várias combinações são mostradas na Tabela Suplementar S1. Dois casos que apresentaram propriedades estáveis ​​e reprodutíveis (cone de Taylor, geração de EWNS e estabilidade ao longo do tempo) foram selecionados para um estudo abrangente. A Figura 3 mostra os resultados para a carga, tamanho e conteúdo de ROS em ambos os casos. Os resultados também estão resumidos na Tabela 1. Para referência, tanto a Figura 3 quanto a Tabela 1 incluem as propriedades dos EWNS8, 9, 10 e 11 sintetizados anteriormente e não otimizados (EWNS de referência). Os cálculos de significância estatística usando um teste t bicaudal são republicados na Tabela Suplementar S2. Além disso, dados adicionais incluem estudos do efeito do diâmetro do orifício de amostragem do contraeletrodo (D) e da distância entre o eletrodo de aterramento e a ponta (L) (Figuras Suplementares S2 e S3).
(ac) Distribuição de tamanho medida por AFM. (df) Característica de carga superficial. (g) Caracterização de ROS do EPR.
É importante ressaltar também que, para todas as condições acima, a corrente de ionização medida ficou entre 2 e 6 μA e a tensão entre -3,8 e -6,5 kV, resultando em um consumo de energia inferior a 50 mW para este módulo de contato de geração de EWNS. Embora o EWNS tenha sido sintetizado sob alta pressão, os níveis de ozônio foram muito baixos, nunca ultrapassando 60 ppb.
A Figura Suplementar S4 mostra os campos elétricos simulados para os cenários [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. Para os cenários [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], os cálculos do campo são de 2 × 10⁵ V/m e 4,7 × 10⁵ V/m, respectivamente. Isso é esperado, visto que, no segundo caso, a relação tensão-distância é muito maior.
As figuras 3a e 3b mostram o diâmetro do EWNS medido com o AFM8. Os diâmetros médios calculados para o EWNS foram de 27 nm e 19 nm para os esquemas [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. Para os cenários [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], os desvios padrão geométricos das distribuições são de 1,41 e 1,45, respectivamente, indicando uma distribuição de tamanho estreita. Tanto o tamanho médio quanto o desvio padrão geométrico são muito próximos ao do EWNS de referência, em 25 nm e 1,41, respectivamente. A figura 3c mostra a distribuição de tamanho do EWNS de referência medida usando o mesmo método e sob as mesmas condições.
As figuras 3d e 3e mostram os resultados da caracterização da carga. Os dados são médias de 30 medições simultâneas de concentração (#/cm³) e corrente (I). A análise mostra que a carga média no EWNS é de 22 ± 6 e⁻ e 44 ± 6 e⁻ para [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. Elas apresentam cargas superficiais significativamente maiores em comparação com o EWNS de referência (10 ± 2 e⁻), duas vezes maiores que no cenário [-6,5 kV, 4,0 cm] e quatro vezes maiores que no cenário [-3,8 kV, 0,5 cm]. A figura 3f mostra os dados de carga para o EWNS de referência.
A partir dos mapas de concentração do número de EWNS (Figuras Suplementares S5 e S6), observa-se que o cenário [-6,5 kV, 4,0 cm] apresenta um número significativamente maior de partículas do que o cenário [-3,8 kV, 0,5 cm]. Vale ressaltar também que a concentração do número de EWNS foi monitorada por até 4 horas (Figuras Suplementares S5 e S6), período em que a estabilidade da geração de EWNS mostrou níveis semelhantes de concentração de partículas em ambos os casos.
A figura 3g mostra o espectro de EPR após a subtração do controle EWNS otimizado (fundo) em [-6,5 kV, 4,0 cm]. Os espectros de ROS também foram comparados com o cenário Baseline-EWNS de um trabalho publicado anteriormente. O número de EWNS reagindo com armadilhas de spin foi calculado em 7,5 × 10⁴ EWNS/s, valor semelhante ao do Baseline-EWNS8 publicado anteriormente. Os espectros de EPR mostraram claramente a presença de dois tipos de ROS, com O₂⁻ sendo a espécie predominante e OH• sendo menos abundante. Além disso, uma comparação direta das intensidades dos picos mostrou que o EWNS otimizado apresentou um conteúdo de ROS significativamente maior em comparação com o EWNS de referência.
A Figura 4 mostra a eficiência de deposição de EWNS em EPES. Os dados também estão resumidos na Tabela I e comparados com os dados originais de EWNS. Para ambos os casos de EUNS, a deposição se aproxima de 100%, mesmo com uma baixa tensão de 3,0 kV. Tipicamente, 3,0 kV são suficientes para uma deposição de 100%, independentemente da variação da carga superficial. Sob as mesmas condições, a eficiência de deposição de Baseline-EWNS foi de apenas 56% devido à sua menor carga (média de 10 elétrons por EWNS).
A figura 5 e a tabela 2 resumem o valor de inativação de microrganismos inoculados na superfície de tomates após exposição a cerca de 40.000 #/cm³ de EWNS (onda elétrica de nêutrons) durante 45 minutos no modo ideal [-6,5 kV, 4,0 cm]. A inoculação de E. coli e Lactobacillus innocuus apresentou uma redução significativa de 3,8 logs durante os 45 minutos de exposição. Nas mesmas condições, S. enterica apresentou uma redução de 2,2 logs, enquanto S. cerevisiae e M. parafortutum apresentaram uma redução de 1,0 log.
As micrografias eletrônicas (Figura 6) mostram as alterações físicas induzidas pelo EWNS em células inofensivas de Escherichia coli, Streptococcus e Lactobacillus, levando à sua inativação. As bactérias do grupo controle apresentavam membranas celulares intactas, enquanto as bactérias expostas apresentavam membranas externas danificadas.
A análise por microscopia eletrônica de bactérias do grupo controle e das bactérias expostas revelou danos na membrana.
Os dados sobre as propriedades físico-químicas das EWNS otimizadas mostram coletivamente que as propriedades (carga superficial e conteúdo de ROS) das EWNS foram significativamente melhoradas em comparação com os dados de referência de EWNS publicados anteriormente8,9,10,11. Por outro lado, seu tamanho permaneceu na faixa nanométrica, muito semelhante aos resultados relatados anteriormente, permitindo que permanecessem no ar por longos períodos. A polidispersidade observada pode ser explicada por mudanças na carga superficial que determinam o tamanho das EWNS, pela aleatoriedade do efeito Rayleigh e pela potencial coalescência. No entanto, como detalhado por Nielsen et al.22, uma alta carga superficial reduz a evaporação, aumentando efetivamente a energia/tensão superficial da gota de água. Em nossa publicação anterior8, essa teoria foi confirmada experimentalmente para microgotículas22 e EWNS. A perda de carga ao longo do tempo também pode afetar o tamanho e contribuir para a distribuição de tamanho observada.
Além disso, a carga por estrutura é de cerca de 22 a 44 elétrons, dependendo da situação, o que é significativamente maior em comparação com o EWNS básico, que possui uma carga média de 10 ± 2 elétrons por estrutura. No entanto, deve-se notar que esta é a carga média do EWNS. Seto et al. demonstraram que a carga é não homogênea e segue uma distribuição log-normal.²¹ Comparado ao nosso trabalho anterior, dobrar a carga superficial dobra a eficiência de deposição no sistema EPES para quase 100%.¹¹