Kiitos käynnistäsi Nature.com-sivustolla. Käyttämäsi selainversio tukee CSS:ää rajoitetusti. Parhaan käyttökokemuksen saavuttamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan yhteensopivuustilan käytöstä Internet Explorerissa). Sillä välin tuen jatkuvuuden varmistamiseksi renderöimme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Äskettäin on kehitetty kemikaaliton nanoteknologiaan perustuva antimikrobinen alusta, jossa käytetään keinotekoisia vesinanorakenteita (EWNS). EWNS:illä on korkea pintavaraus ja ne ovat kyllästyneitä reaktiivisilla happilajeilla (ROS), jotka voivat olla vuorovaikutuksessa useiden mikro-organismien, mukaan lukien elintarvikkeista peräisin olevien patogeenien, kanssa ja inaktivoida niitä. Tässä osoitetaan, että niiden ominaisuuksia synteesin aikana voidaan hienosäätää ja optimoida niiden antibakteerisen potentiaalin parantamiseksi entisestään. EWNS-laboratorioalusta suunniteltiin EWNS:ien ominaisuuksien hienosäätämiseksi muuttamalla synteesiparametreja. EWNS:ien ominaisuuksien (ROS:n varaus, koko ja pitoisuus) karakterisointi käyttäen nykyaikaisia ​​analyyttisiä menetelmiä. Lisäksi niiden mikrobien inaktivointipotentiaalia arvioitiin elintarvikkeista peräisin olevia mikro-organismeja, kuten Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum ja Saccharomyces cerevisiae, vastaan. Tässä esitetyt tulokset osoittavat, että EWNS:ien ominaisuuksia voidaan hienosäätää synteesin aikana, mikä johtaa inaktivointitehokkuuden eksponentiaaliseen kasvuun. Erityisesti pintavaraus kasvoi nelinkertaiseksi ja reaktiivisten happilajien määrä lisääntyi. Mikrobien poistonopeus riippui mikrobitasosta ja vaihteli 1,0:stä 3,8 log10:een 45 minuutin altistuksen jälkeen 40 000 #/cc EWNS -aerosoliannokselle.
Mikrobien aiheuttama kontaminaatio on tärkein syy ruokamyrkytykseen, jonka aiheuttavat taudinaiheuttajien tai niiden toksiinien nauttiminen. Pelkästään Yhdysvalloissa ruokamyrkytys aiheuttaa vuosittain noin 76 miljoonaa sairastumista, 325 000 sairaalahoitoa ja 5 000 kuolemantapausta1. Lisäksi Yhdysvaltain maatalousministeriö (USDA) arvioi, että tuoreiden tuotteiden lisääntynyt kulutus on vastuussa 48 prosentista kaikista Yhdysvalloissa raportoiduista ruokamyrkytystapauksista2. Ruokamyrkytystapausten aiheuttamien sairauksien ja kuolemien kustannukset Yhdysvalloissa ovat erittäin korkeat, ja tautien torjunta- ja ehkäisykeskukset (CDC) arvioivat niiden olevan yli 15,6 miljardia Yhdysvaltain dollaria vuodessa3.
Tällä hetkellä kemiallisia4, säteily-5 ja termisiä6 antimikrobisia toimenpiteitä elintarviketurvallisuuden varmistamiseksi suoritetaan enimmäkseen rajoitetuissa kriittisissä valvontapisteissä (CCP) tuotantoketjussa (yleensä sadonkorjuun jälkeen ja/tai pakkauksen aikana) jatkuvasti. Näin ollen ne ovat alttiita ristikontaminaatiolle. 7. Elintarvikkeista peräisin olevien sairauksien ja elintarvikkeiden pilaantumisen parempi hallinta edellyttää antimikrobisia toimenpiteitä, joita voidaan mahdollisesti soveltaa koko maatilalta pöytään -jatkumossa samalla vähentäen ympäristövaikutuksia ja kustannuksia.
Äskettäin on kehitetty kemikaaliton, nanoteknologiaan perustuva antimikrobinen alusta, joka voi inaktivoida pinta- ja ilmassa olevia bakteereja käyttämällä keinotekoisia veden nanorakenteita (EWNS). EWNS syntetisoitiin käyttämällä kahta rinnakkaista prosessia, sähkösuihkutusta ja vesiionisaatiota (kuva 1a). Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että EWNS:llä on ainutlaatuinen joukko fysikaalisia ja biologisia ominaisuuksia8,9,10. EWNS:llä on keskimäärin 10 elektronia rakennetta kohden ja keskimääräinen nanoskaalan koko on 25 nm (kuva 1b,c)8,9,10. Lisäksi elektronispinresonanssi (ESR) osoitti, että EWNS sisältää suuren määrän reaktiivisia happilajeja (ROS), pääasiassa hydroksyyli- (OH•) ja superoksidiradikaaleja (O2-) (kuva 1c)8. EVNS on ilmassa pitkään ja voi törmätä ilmassa leijuviin ja pinnalla oleviin mikro-organismeihin, jolloin ne kuljettavat ROS-hyötykuormaansa ja inaktivoivat mikro-organismeja (kuva 1d). Nämä varhaiset tutkimukset osoittivat myös, että EWNS voi olla vuorovaikutuksessa useiden gramnegatiivisten ja grampositiivisten bakteerien, mukaan lukien mykobakteerien, kanssa ja inaktivoida niitä pinnoilla ja ilmassa. Läpäisyelektronimikroskopia osoitti, että inaktivaation aiheutti solukalvon vaurioituminen. Lisäksi akuutit inhalaatiotutkimukset ovat osoittaneet, että suuret EWNS-annokset eivät aiheuta keuhkovaurioita tai tulehdusta8.
(a) Sähkösuihkutus tapahtuu, kun nestettä sisältävän kapillaariputken ja vastaelektrodin väliin kohdistetaan korkea jännite. (b) Korkean paineen kohdistaminen johtaa kahteen eri ilmiöön: (i) veden sähkösuihkutukseen ja (ii) reaktiivisten happilajien (ionien) muodostumiseen, jotka jäävät loukkuun EWNS:ään. (c) EWNS:n ainutlaatuinen rakenne. (d) Nanoskaalan luonteensa vuoksi EWNS:t ovat erittäin liikkuvia ja voivat olla vuorovaikutuksessa ilmassa olevien patogeenien kanssa.
EWNS-antimikrobiaalisen alustan kyky inaktivoida elintarvikkeista peräisin olevia mikro-organismeja tuoreen elintarvikkeen pinnalla on myös äskettäin osoitettu. On myös osoitettu, että EWNS:n pintavarausta yhdessä sähkökentän kanssa voidaan käyttää kohdennetun annostelun saavuttamiseksi. Lisäksi alustavat tulokset luomutomaateilla 90 minuutin altistuksen jälkeen noin 50 000 #/cm3:n EWNS-pitoisuudella olivat rohkaisevia, ja havaittiin useita elintarvikkeista peräisin olevia mikro-organismeja, kuten E. coli ja Listeria 11. Lisäksi alustavat aistinvaraiset testit eivät osoittaneet aistinvaraisia ​​vaikutuksia verrattuna kontrollitomaatteihin. Vaikka nämä alustavat inaktivointitulokset ovat rohkaisevia elintarviketurvallisuussovelluksissa jopa hyvin pienillä 50 000 #/cc:n EWNS-annoksilla, on selvää, että suurempi inaktivointipotentiaali olisi hyödyllisempi infektio- ja pilaantumisriskin vähentämiseksi entisestään.
Tässä keskitymme tutkimukseemme EWNS-sukupolvialustan kehittämiseen, jonka avulla synteesiparametreja voidaan hienosäätää ja EWNS-sukupolvien fysikaalis-kemiallisia ominaisuuksia optimoida niiden antibakteerisen potentiaalin parantamiseksi. Optimointi on keskittynyt erityisesti niiden pintavarauksen (kohdennetun kulkeutumisen parantamiseksi) ja ROS-pitoisuuden (inaktivointitehokkuuden parantamiseksi) lisäämiseen. Karakterisoimme optimoituja fysikaalis-kemiallisia ominaisuuksia (koko, varaus ja ROS-pitoisuus) käyttämällä nykyaikaisia ​​analyyttisiä menetelmiä ja käytämme yleisiä elintarvike-mikro-organismeja, kuten E.
EVNS syntetisoitiin samanaikaisesti sähköruiskutuksella ja ionisaatiolla erittäin puhtaasta vedestä (18 MΩ cm–1). Sähköistä sumutinta 12 käytetään tyypillisesti nesteiden sumutukseen ja kontrolloidun kokoisten polymeeri- ja keraamisten hiukkasten 13 ja kuitujen 14 synteesiin.
Kuten aiemmissa julkaisuissa 8, 9, 10, 11 on yksityiskohtaisesti kuvattu, tyypillisessä kokeessa metallikapillaarin ja maadoitetun vastaelektrodin väliin kohdistettiin korkea jännite. Tämän prosessin aikana tapahtuu kaksi eri ilmiötä: i) sähkösuihkutus ja ii) veden ionisaatio. Kahden elektrodin välinen voimakas sähkökenttä aiheuttaa negatiivisten varausten kertymistä kondensoituneen veden pinnalle, mikä johtaa Taylor-kartioiden muodostumiseen. Tämän seurauksena muodostuu erittäin varautuneita vesipisaroita, jotka hajoavat edelleen pienemmiksi hiukkasiksi, kuten Rayleigh'n teoriassa16. Samaan aikaan voimakkaat sähkökentät aiheuttavat joidenkin vesimolekyylien jakautumisen ja elektronien irrottamisen (ionisoitumisen), mikä johtaa suuren määrän reaktiivisten happilajien (ROS)17 muodostumiseen. Samanaikaisesti syntynyt ROS18 kapseloitiin EWNS:ään (kuva 1c).
Kuvassa 2a on esitetty tässä tutkimuksessa kehitetty ja käytetty EWNS-synteesissä käytetty EWNS-generointijärjestelmä. Suljetussa pullossa säilytettyä puhdistettua vettä syötettiin teflonputken (sisähalkaisija 2 mm) läpi 30G:n ruostumattomasta teräksestä valmistettuun neulaan (metallinen kapillaari). Veden virtausta säädellään pullon sisällä olevalla ilmanpaineella, kuten kuvassa 2b on esitetty. Neula on asennettu teflon-konsoliin ja sitä voidaan säätää manuaalisesti tietylle etäisyydelle vastaelektrodista. Vastaelektrodi on kiillotettu alumiinilevy, jonka keskellä on reikä näytteenottoa varten. Vastaelektrodin alapuolella on alumiininen näytteenottosuppilo, joka on yhdistetty muuhun kokeelliseen laitteistoon näytteenottoportin kautta (kuva 2b). Jotta vältetään näytteenottimen toimintaa häiritsevä varauksen kertyminen, kaikki näytteenottimen komponentit on maadoitettu sähköisesti.
(a) Teknisen veden nanorakenteiden generointijärjestelmä (EWNS). (b) Näytteenottajan ja sähköruiskutuksen poikkileikkaus, jossa näkyvät tärkeimmät parametrit. (c) Bakteerien inaktivoinnin kokeellinen järjestely.
Edellä kuvattu EWNS-generointijärjestelmä pystyy muuttamaan keskeisiä toimintaparametreja EWNS-ominaisuuksien hienosäädön helpottamiseksi. Säädä käytettyä jännitettä (V), neulan ja vastaelektrodin välistä etäisyyttä (L) ja veden virtausta (φ) kapillaarin läpi EWNS-ominaisuuksien hienosäätämiseksi. Eri yhdistelmiä edustavat symbolit: [V (kV), L (cm)]. Säädä veden virtausta saadaksesi vakaan Taylor-kartion tietyllä joukolla [V, L]. Tässä tutkimuksessa vastaelektrodin aukon halkaisija (D) pidettiin 0,5 tuumassa (1,29 cm).
Rajoitetun geometrian ja epäsymmetrian vuoksi sähkökentän voimakkuutta ei voida laskea ensisijaisten periaatteiden perusteella. Sen sijaan sähkökentän laskemiseen käytettiin QuickField™-ohjelmistoa (Svendborg, Tanska)19. Sähkökenttä ei ole tasainen, joten kapillaarin kärjessä olevan sähkökentän arvoa käytettiin vertailuarvona eri konfiguraatioissa.
Tutkimuksen aikana arvioitiin useita neulan ja vastaelektrodin välisen jännitteen ja etäisyyden yhdistelmiä Taylor-kartion muodostumisen, Taylor-kartion vakauden, EWNS-tuotannon vakauden ja toistettavuuden kannalta. Erilaisia ​​yhdistelmiä on esitetty lisätaulukossa S1.
EWNS-generointijärjestelmän lähtö kytkettiin suoraan Scanning Mobility Particle Size Analyzer -laitteeseen (SMPS, malli 3936, TSI, Shoreview, MN) hiukkasten lukumäärän pitoisuuden mittaamiseksi sekä Aerosol Faraday -elektrometriin (TSI, malli 3068B, Shoreview, MN). ) aerosolivirtojen mittaamiseksi mitattiin edellisessä julkaisussamme kuvatulla tavalla. Sekä SMPS että aerosolielektrometri ottivat näytteen virtausnopeudella 0,5 l/min (näytteen kokonaisvirtaus 1 l/min). Hiukkasten lukumääräpitoisuus ja aerosolivirtaus mitattiin 120 sekunnin ajan. Mittaus toistetaan 30 kertaa. Virtamittausten perusteella lasketaan aerosolin kokonaisvaraus ja keskimääräinen EWNS-varaus arvioidaan tietylle valittujen EWNS-hiukkasten kokonaismäärälle. EWNS:n keskimääräiset kustannukset voidaan laskea yhtälöllä (1):
jossa IEl on mitattu virta, NSMPS on SMPS:llä mitattu digitaalinen pitoisuus ja φEl on virtausnopeus elektrometriä kohden.
Koska suhteellinen kosteus (RH) vaikuttaa pintavaraukseen, lämpötila ja (RH) pidettiin kokeen aikana vakioina, vastaavasti 21 °C:ssa ja 45 %:ssa.
EWNS:n koon ja eliniän mittaamiseen käytettiin atomivoimamikroskopiaa (AFM), Asylum MFP-3D -laitetta (Asylum Research, Santa Barbara, CA) ja AC260T-anturia (Olympus, Tokio, Japani). AFM-skannaustaajuus oli 1 Hz, skannausalue oli 5 μm × 5 μm ja skannausviivaa oli 256. Kaikille kuville tehtiin ensimmäisen asteen kuvankohdistus Asylum-ohjelmistolla (maskin alue 100 nm, kynnys 100 pm).
Testisuppilo poistettiin ja kiillepinta asetettiin 2,0 cm:n etäisyydelle vastaelektrodista 120 sekunnin keskiarvoistusajaksi hiukkasten agglomeraation ja epäsäännöllisten pisaroiden muodostumisen välttämiseksi kiillepinnalle. EWNS ruiskutettiin suoraan vastaleikatun kiilteen pinnalle (Ted Pella, Redding, CA). Kuva kiillepinnasta heti AFM-sputteroinnin jälkeen. Vastaleikatun muokkaamattoman kiilteen pinnan kosketuskulma on lähellä 0°, joten EVNS jakautuu kiilteen pinnalle kuvun muodossa. Difundoituvien pisaroiden halkaisija (a) ja korkeus (h) mitattiin suoraan AFM-topografiasta ja niitä käytettiin EWNS:n kupumaisen diffuusiotilavuuden laskemiseen aiemmin validoidulla menetelmällämme. Olettaen, että laitteeseen asennetuilla EWNS:illä on sama tilavuus, ekvivalenttihalkaisija voidaan laskea yhtälöllä (2):
Aiemmin kehittämämme menetelmän pohjalta käytettiin elektronispinresonanssiin (ESR) perustuvaa spinloukkua lyhytikäisten radikaalivälituotteiden havaitsemiseksi EWNS:ssä. Aerosolit kuplitettiin 650 μm:n Midget-suihkuttimen (Ace Glass, Vineland, NJ) läpi, joka sisälsi 235 mM DEPMPO(5-(dietoksifosforyyli)-5-metyyli-1-pyrroliini-N-oksidi) (Oxis International Inc.) -liuosta. Portland, Oregon). Kaikki ESR-mittaukset tehtiin Bruker EMX -spektrometrillä (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) ja litteänäyttöisellä kyvetillä. Datan keräämiseen ja analysointiin käytettiin Acquisit-ohjelmistoa (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA). ROS:n ominaisuuksien määritys suoritettiin vain tietyille käyttöolosuhteille [-6,5 kV, 4,0 cm]. EWNS-pitoisuudet mitattiin SMPS:llä, kun oli otettu huomioon EWNS-häviöt impaktorissa.
Otsonitasoja seurattiin käyttämällä 205 Dual Beam Ozone Monitor™ -laitetta (2B Technologies, Boulder, Colorado)8,9,10.
Kaikkien EWNS-ominaisuuksien osalta mittausarvona käytetään keskiarvoa ja mittausvirheenä keskihajontaa. T-testejä tehtiin optimoitujen EWNS-attribuuttien arvojen vertaamiseksi perus-EWNS:n vastaaviin arvoihin.
Kuva 2c esittää aiemmin kehitetyn ja karakterisoidun sähköstaattisen saostuksen (EPES) "veto"järjestelmän, jota voidaan käyttää EWNS:n kohdennettuun toimittamiseen pinnalle. EPES käyttää EVNS-varauksia, jotka voidaan "ohjata" suoraan kohteen pinnalle voimakkaan sähkökentän vaikutuksesta. EPES-järjestelmän yksityiskohdat esitetään Pyrgiotakis et al.:n äskettäisessä julkaisussa 11. EPES koostuu siis 3D-tulostetusta PVC-kammiosta, jossa on kapenevat päät ja joka sisältää kaksi rinnakkaista ruostumattomasta teräksestä (304 ruostumaton teräs, peilipinnoitettu) valmistettua metallilevyä keskellä 15,24 cm:n etäisyydellä toisistaan. Levyt oli kytketty ulkoiseen korkeajännitelähteeseen (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), pohjalevy oli aina kytketty positiiviseen jännitteeseen ja ylälevy oli aina kytketty maahan (kelluva maadoitus). Kammion seinät on peitetty alumiinifoliolla, joka on sähköisesti maadoitettu hiukkasten häviämisen estämiseksi. Kammiossa on suljettu etulatausluukku, jonka avulla testipinnat voidaan asettaa muovitelineille, jotka nostavat ne pohjalevyn yläpuolelle korkeajännitehäiriöiden välttämiseksi.
EWNS:n laskeutumistehokkuus EPES:ssä laskettiin aiemmin kehitetyn protokollan mukaisesti, joka on yksityiskohtaisesti esitetty lisäkuvassa S111.
Ohjauskammiona EPES-järjestelmään oli sarjaan kytketty toinen lieriömäinen virtauskammio, jossa välissä olevaa HEPA-suodatinta käytettiin EWNS:n poistamiseen. Kuten kuvassa 2c on esitetty, EWNS-aerosolia pumpattiin kahden sisäänrakennetun kammion läpi. Ohjaushuoneen ja EPES:n välinen suodatin poistaa kaikki jäljellä olevat EWNS:t, jolloin lämpötila (T), suhteellinen kosteus (RH) ja otsonipitoisuudet pysyivät samoina.
Tärkeiden elintarvikeperäisten mikro-organismien on havaittu saastuttavan tuoreita elintarvikkeita, kuten E. coli (ATCC #27325), ulosteindikaattori, Salmonella enterica (ATCC #53647), elintarvikeperäinen patogeeni, Listeria harmless (ATCC #33090), patogeenisen Listeria monocytogenes -bakteerin korvike, joka on johdettu ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) -bakteerista, pilaantumishiivan korvike, ja vastustuskykyisempi inaktivoitu bakteeri, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Osta paikalliselta torilta satunnaisia ​​laatikoita luomurypäletomaatteja ja säilytä niitä jääkaapissa 4 °C:ssa käyttöön asti (enintään 3 päivää). Koetomaatit olivat kaikki saman kokoisia, halkaisijaltaan noin 1,5 cm.
Viljely-, inokulaatio-, altistus- ja pesäkemäärän mittausprotokollat ​​on kuvattu yksityiskohtaisesti edellisessä julkaisussamme ja lisätiedoissa. EWNS:n tehokkuutta arvioitiin altistamalla inokuloidut tomaatit 40 000 #/cm3:lle 45 minuutin ajan. Lyhyesti sanottuna kolmea tomaattia käytettiin eloonjääneiden mikro-organismien arviointiin ajanhetkellä t = 0 min. Kolme tomaattia laitettiin EPES-kammioon ja altistettiin EWNS:lle 40 000 #/cc:n pitoisuudella (EWNS:lle altistetut tomaatit) ja loput kolme laitettiin kontrollikammioon (kontrollitomaatit). Kummassakaan ryhmässä tomaatteja ei käsitelty lisäkäsittelyn avulla. EWNS:lle altistetut tomaatit ja kontrollitomaatit poistettiin 45 minuutin kuluttua EWNS:n vaikutuksen arvioimiseksi.
Jokainen koe suoritettiin kolmena kappaleena. Data-analyysi suoritettiin lisätiedoissa kuvatun protokollan mukaisesti.
Inaktivaatiomekanismeja arvioitiin sedimentoimalla altistuneita EWNS-näytteitä (45 min 40 000 #/cm3 EWNS-aerosolipitoisuudella) ja säteilyttämättömiä vaarattomia bakteereja, E. coli, Salmonella enterica ja Lactobacillus. Partikkelit fiksoitiin 2,5 % glutaraldehydillä, 1,25 % paraformaldehydillä ja 0,03 % pikriinihapolla 0,1 M natriumkakodylaattipuskurissa (pH 7,4) 2 tunnin ajan huoneenlämmössä. Pesun jälkeen jälkifiksoitiin 1 % osmiumtetroksidilla (OsO4) / 1,5 % kaliumferrosyanidilla (KFeCN6) 2 tunnin ajan, pestiin kolme kertaa vedessä ja inkuboitiin 1 % uranyyliasetaatissa 1 tunnin ajan, pestiin sitten kahdesti vedessä ja kuivattiin lopuksi 10 minuuttia 50 %, 70 %, 90 % ja 100 % alkoholissa. Näytteet asetettiin sitten propyleenioksidiin yhdeksi tunniksi ja kyllästettiin propyleenioksidin ja TAAP Eponin 1:1-seoksella (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Näytteet upotettiin TAAB Eponiin ja polymeroitiin 60 °C:ssa 48 tuntia. Kovettunut rakeinen hartsi leikattiin ja visualisoitiin TEM:llä käyttäen tavanomaista läpäisyelektronimikroskooppia JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japani), joka oli varustettu AMT 2k CCD-kameralla (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, USA).
Kaikki kokeet tehtiin kolmena rinnakkaisnäytteenä. Jokaista aikapistettä kohden bakteeripesuliuokset kylvettiin kolmena rinnakkaisnäytteenä, jolloin saatiin yhteensä yhdeksän datapistettä pistettä kohden, joiden keskiarvoa käytettiin kyseisen mikro-organismin bakteeripitoisuutena. Keskihajontaa käytettiin mittausvirheenä. Kaikki pisteet lasketaan.
Bakteeripitoisuuden laskun logaritmi verrattuna aikaan t = 0 min laskettiin seuraavalla kaavalla:
jossa C0 on bakteerien pitoisuus kontrollinäytteessä ajanhetkellä 0 (eli pinnan kuivuttua, mutta ennen kammioon asettamista) ja Cn on bakteerien pitoisuus pinnalla n minuutin altistuksen jälkeen.
Bakteerien luonnollisen hajoamisen huomioon ottamiseksi 45 minuutin altistuksen aikana laskettiin myös logaritminen väheneminen kontrolliin verrattuna 45 minuutin kuluttua seuraavasti:
jossa Cn on bakteerien pitoisuus kontrollinäytteessä ajanhetkellä n ja Cn-kontrolli on kontrollibakteerien pitoisuus ajanhetkellä n. Tiedot esitetään logaritmisena vähennyksenä verrattuna kontrolliin (ei EWNS-altistusta).
Tutkimuksen aikana arvioitiin useita neulan ja vastaelektrodin välisen jännitteen ja etäisyyden yhdistelmiä Taylor-kartion muodostumisen, Taylor-kartion stabiilisuuden, EWNS-tuotannon stabiilisuuden ja toistettavuuden kannalta. Erilaisia ​​yhdistelmiä on esitetty lisätaulukossa S1. Kattavaan tutkimukseen valittiin kaksi tapausta, jotka osoittivat stabiileja ja toistettavia ominaisuuksia (Taylor-kartio, EWNS-tuotannon stabiilisuus ja stabiilisuus ajan kuluessa). Kuvassa 3 on esitetty ROS-yhdisteiden varauksen, koon ja pitoisuuden tulokset molemmissa tapauksissa. Tulokset on myös esitetty yhteenvetona taulukossa 1. Sekä kuvassa 3 että taulukossa 1 on esitetty aiemmin syntetisoitujen, optimoimattomien EWNS-yhdisteiden 8, 9, 10, 11 (lähtötaso-EWNS) ominaisuudet. Tilastollisen merkitsevyyden laskelmat, joissa käytettiin kaksisuuntaista t-testiä, on julkaistu uudelleen lisätaulukossa S2. Lisäksi lisätiedot sisältävät tutkimuksia vastaelektrodin näytteenottoreiän halkaisijan (D) ja maadoituselektrodin ja kärjen välisen etäisyyden (L) vaikutuksesta (lisäkuvat S2 ja S3).
(ac) AFM:llä mitattu kokojakauma. (df) Pintavarauksen karakterisointi. (g) EPR:n ROS-karakterisointi.
On myös tärkeää huomata, että kaikissa edellä mainituissa olosuhteissa mitattu ionisaatiovirta oli 2–6 μA ja jännite -3,8–6,5 kV, mikä johti alle 50 mW:n tehonkulutukseen tällä yksittäisellä EWNS-sukupolven kontaktimoduulilla. Vaikka EWNS syntetisoitiin korkeassa paineessa, otsonipitoisuudet olivat hyvin alhaiset, eivätkä koskaan ylittäneet 60 ppb:tä.
Lisäkuva S4 esittää simuloidut sähkökentät skenaarioissa [-6,5 kV, 4,0 cm] ja [-3,8 kV, 0,5 cm]. Skenaarioissa [-6,5 kV, 4,0 cm] ja [-3,8 kV, 0,5 cm] kenttälaskelmat ovat vastaavasti 2 × 105 V/m ja 4,7 × 105 V/m. Tämä on odotettavissa, koska jälkimmäisessä tapauksessa jännite-etäisyys-suhde on paljon suurempi.
Kuvassa 3a, b on esitetty AFM8:lla mitattu EWNS:n halkaisija. Lasketut keskimääräiset EWNS:n halkaisijat olivat 27 nm ja 19 nm vastaavasti skenaarioilla [-6,5 kV, 4,0 cm] ja [-3,8 kV, 0,5 cm]. Skenaarioissa [-6,5 kV, 4,0 cm] ja [-3,8 kV, 0,5 cm] jakaumien geometriset keskihajonnat ovat vastaavasti 1,41 ja 1,45, mikä osoittaa kapeaa kokojakaumaa. Sekä keskimääräinen koko että geometrinen keskihajonta ovat hyvin lähellä EWNS:n perustason kokojakaumaa, 25 nm ja 1,41. Kuvassa 3c on esitetty samalla menetelmällä ja samoissa olosuhteissa mitatun perus-EWNS:n kokojakauma.
Kuvassa 3d,e on esitetty varauksen karakterisoinnin tulokset. Tiedot ovat 30 samanaikaisen pitoisuus- (#/cm3) ja virta- (I) -mittauksen keskiarvoja. Analyysi osoittaa, että EWNS:n keskimääräinen varaus on 22 ± 6 e- ja 44 ± 6 e- vastaavasti [-6,5 kV, 4,0 cm] ja [-3,8 kV, 0,5 cm]. Niillä on merkittävästi suuremmat pintavaraukset verrattuna perustason EWNS:ään (10 ± 2 e-), kaksi kertaa suurempi kuin [-6,5 kV, 4,0 cm] -skenaariossa ja neljä kertaa suurempi kuin [-3,8 kV, 0,5 cm]. Kuva 3f esittää perustason EWNS:n varaustiedot.
EWNS-lukumäärän pitoisuuskartoista (lisäkuvat S5 ja S6) voidaan nähdä, että skenaariossa [-6,5 kV, 4,0 cm] on huomattavasti enemmän hiukkasia kuin skenaariossa [-3,8 kV, 0,5 cm]. On myös syytä huomata, että EWNS-lukumäärän pitoisuutta seurattiin jopa 4 tunnin ajan (lisäkuvat S5 ja S6), jolloin EWNS-sukupolven stabiilius osoitti molemmissa tapauksissa samoja hiukkasmäärän pitoisuuksia.
Kuvassa 3g on EPR-spektri optimoidun EWNS-kontrollin (tausta) vähentämisen jälkeen kohdassa [-6,5 kV, 4,0 cm]. ROS-spektrejä verrattiin myös aiemmin julkaistun työn Baseline-EWNS-skenaarioon. Spinloukkujen kanssa reagoivien EWNS-yhdisteiden määräksi laskettiin 7,5 × 104 EWNS/s, mikä on samankaltainen kuin aiemmin julkaistussa Baseline-EWNS8:ssa. EPR-spektrit osoittivat selvästi kahdenlaisten ROS-yhdisteiden läsnäolon, O2-:n ollessa vallitseva laji ja OH•:n ollessa vähemmän runsas. Lisäksi piikkien intensiteettien suora vertailu osoitti, että optimoidulla EWNS:llä oli merkittävästi korkeampi ROS-pitoisuus verrattuna perustason EWNS:ään.
Kuvassa 4 on esitetty EWNS:n laskeutumistehokkuus EPES:ssä. Tiedot on myös esitetty yhteenvetona taulukossa I ja niitä on verrattu alkuperäisiin EWNS-tietoihin. Molemmissa EUNS-tapauksissa laskeuma on lähes 100 % jopa alhaisella 3,0 kV:n jännitteellä. Tyypillisesti 3,0 kV riittää 100 %:n laskeumaan pintavarauksen muutoksesta riippumatta. Samoissa olosuhteissa Baseline-EWNS:n laskeutumistehokkuus oli vain 56 % niiden alhaisemman varauksen vuoksi (keskimäärin 10 elektronia EWNS:ää kohden).
Kuvassa 5 ja taulukossa 2 on yhteenveto tomaattien pinnalle inokuloitujen mikro-organismien inaktivaatioarvosta noin 40 000 #/cm3 EWNS-altistuksen jälkeen 45 minuutin ajan optimaalisella moodilla [-6,5 kV, 4,0 cm]. Inokuloidut E. coli- ja Lactobacillus innocuous -bakteerit osoittivat merkittävää 3,8 logaritmin laskua 45 minuutin altistuksen aikana. Samoissa olosuhteissa S. enterica -bakteerien lasku oli 2,2 logaritmia, kun taas S. cerevisiae- ja M. parafortutum -bakteerien lasku oli 1,0 logaritmia.
Elektronimikroskooppikuvat (kuva 6) kuvaavat EWNS:n aiheuttamia fysikaalisia muutoksia vaarattomissa Escherichia coli-, Streptococcus- ja Lactobacillus-soluissa, jotka johtavat niiden inaktivoitumiseen. Kontrollibakteereilla oli ehjät solukalvot, kun taas altistuneilla bakteereilla oli vaurioituneet ulkokalvot.
Kontrollin ja altistuneiden bakteerien elektronimikroskooppinen kuvantaminen paljasti kalvovaurioita.
Optimoitujen EWNS-näytteiden fysikaalis-kemiallisia ominaisuuksia koskevat tiedot osoittavat yhdessä, että EWNS-näytteiden ominaisuudet (pintavaraus ja ROS-pitoisuus) paranivat merkittävästi aiemmin julkaistuihin EWNS-lähtötietoihin verrattuna8,9,10,11. Toisaalta niiden koko pysyi nanometrialueella, hyvin samankaltaisena kuin aiemmin raportoidut tulokset, minkä ansiosta ne voivat pysyä ilmassa pitkiä aikoja. Havaittu polydispersiteetti voidaan selittää pintavarauksen muutoksilla, jotka määräävät EWNS-näytteiden koon, Rayleigh-ilmiön satunnaisuudella ja mahdollisella koalesenssilla. Kuten Nielsen ym.22 ovat yksityiskohtaisesti esittäneet, suuri pintavaraus vähentää haihtumista lisäämällä tehokkaasti vesipisaran pintaenergiaa/jännitystä. Edellisessä julkaisussamme8 tämä teoria vahvistettiin kokeellisesti mikropisaroille22 ja EWNS-näytteille. Varauksen menetys ajan myötä voi myös vaikuttaa kokoon ja vaikuttaa havaittuun kokojakaumaan.
Lisäksi varaus rakennetta kohden on tilanteesta riippuen noin 22–44 e-, mikä on huomattavasti korkeampi verrattuna perus-EWNS:ään, jonka keskimääräinen varaus on 10 ± 2 elektronia rakennetta kohden. On kuitenkin huomattava, että tämä on EWNS:n keskimääräinen varaus. Seto ym. on osoitettu, että varaus on epähomogeeninen ja noudattaa log-normaalijakaumaa21. Aiempaan työhömme verrattuna pintavarauksen kaksinkertaistaminen kaksinkertaistaa EPES-järjestelmän laskeutumistehokkuuden lähes 100 prosenttiin11.