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近年、人工水ナノ構造（EWNS）を用いたナノテクノロジーに基づく化学物質不使用の抗菌プラットフォームが開発されました。EWNSは表面電荷が高く、活性酸素種（ROS）が飽和しており、食中毒菌を含む多くの微生物と相互作用して不活性化することができます。本研究では、合成中の特性を微調整および最適化することで、抗菌能をさらに高めることができることを示しました。EWNSラボプラットフォームは、合成パラメータを変更することでEWNSの特性を微調整できるように設計されました。最新の分析方法を用いて、EWNSの特性（電荷、サイズ、ROS含有量）を特性評価しました。さらに、大腸菌、サルモネラ菌、リステリア菌、マイコバクテリウム・パラアクシデンタム、サッカロミセス・セレビシエなどの食中毒菌に対する微生物不活性化能を評価しました。本研究で得られた結果は、EWNSの特性を合成中に微調整することで、不活性化効率が飛躍的に向上することを示しています。特に、表面電荷は4倍に増加し、活性酸素種も増加した。微生物除去率は微生物の種類によって異なり、40,000 #/cc EWNSのエアロゾル投与量に45分間曝露した後、1.0～3.8 logの範囲であった。
微生物汚染は、病原体やその毒素の摂取によって引き起こされる食中毒の主な原因です。米国だけでも、食中毒は毎年約7,600万人の罹患、32万5,000人の入院、5,000人の死亡を引き起こしています1。さらに、米国農務省（USDA）は、生鮮食品の消費量の増加が、米国で報告されている食中毒全体の48%の原因となっていると推定しています2。米国における食中毒病原体による疾病と死亡のコストは非常に高く、疾病管理予防センター（CDC）は年間156億ドル以上と推定しています3。
現在、食品の安全性を確保するための化学的4、放射線5、熱6による抗菌介入は、生産チェーンに沿った限られた重要管理点（CCP）（通常は収穫後および/または包装中）で継続的に行われるのではなく、主にそこで実施されています。そのため、交差汚染が発生しやすいです。7. 食中毒や食品の腐敗をより適切に管理するには、環境への影響とコストを削減しながら、農場から食卓までの連続体全体に適用できる可能性のある抗菌介入が必要です。
最近、人工水ナノ構造（EWNS）を用いて表面および空気中の細菌を不活性化できる、化学物質不使用のナノテクノロジーベースの抗菌プラットフォームが開発されました。EWNSは、エレクトロスプレーと水のイオン化という2つの並行プロセスを使用して合成されました（図1a）。これまでの研究では、EWNSは独自の物理的および生物学的特性セットを持っていることが示されています8,9,10。EWNSは、構造あたり平均10個の電子を持ち、平均ナノスケールサイズは25 nmです（図1b、c）8,9,10。さらに、電子スピン共鳴（ESR）により、EWNSには、主にヒドロキシル（OH•）ラジカルとスーパーオキシド（O2-）ラジカルなどの活性酸素種（ROS）が大量に含まれていることが示されました（図1c）8。EVNSは長時間空気中に存在し、空気中に浮遊している微生物や表面に存在する微生物と衝突し、ROSを放出して微生物を不活性化することができます（図1d）。これらの初期の研究では、EWNSが表面や空気中のマイコバクテリアを含む様々なグラム陰性菌およびグラム陽性菌と相互作用して不活化することも示されました。透過型電子顕微鏡観察により、不活化は細胞膜の破壊によって引き起こされることが示されました。さらに、急性吸入試験では、高用量のEWNSが肺の損傷や炎症を引き起こさないことが示されています8。
(a) 液体を含む毛細管と対向電極の間に高電圧を印加すると、エレクトロスプレーが発生します。(b) 高圧を印加すると、(i) 水のエレクトロスプレーと (ii) EWNS 内に捕捉された活性酸素種 (イオン) の形成という 2 つの異なる現象が発生します。(c) EWNS の独特な構造。(d) ナノスケールであるため、EWNS は非常に移動性が高く、空気中の病原体と相互作用することができます。
EWNS抗菌プラットフォームが生鮮食品表面の食中毒微生物を不活化できることも最近実証されました。また、EWNSの表面電荷と電場を組み合わせることで、標的送達を実現できることも示されています。さらに、有機トマトを約50,000 #/cm3のEWNSに90分間曝露した後の予備的な結果は有望で、大腸菌やリステリア菌などの様々な食中毒微生物が観察されました。加えて、予備的な官能検査では、対照トマトと比較して感覚的な影響は見られませんでした。これらの初期の不活化結果は、50,000#/ccという非常に低いEWNS投与量でも食品安全用途にとって有望ですが、感染や腐敗のリスクをさらに低減するには、より高い不活化ポテンシャルの方がより有益であることは明らかです。
ここでは、EWNSの合成パラメータの微調整と、抗菌性を高めるためのEWNSの物理化学的特性の最適化を可能にするEWNS生成プラットフォームの開発に研究の焦点を当てます。特に、最適化は、表面電荷（標的送達を改善するため）とROS含有量（不活性化効率を向上させるため）の増加に焦点を当てています。最適化された物理化学的特性（サイズ、電荷、ROS含有量）を最新の分析方法を使用して特性評価し、E.などの一般的な食品微生物を使用します。
EVNSは、高純度水（18 MΩ cm–1）の同時電気噴霧およびイオン化によって合成された。電気噴霧器12は、一般的に液体の噴霧、およびサイズ制御されたポリマーおよびセラミック粒子13と繊維14の合成に使用される。
以前の出版物8、9、10、11で詳述されているように、典型的な実験では、金属毛細管と接地された対向電極の間に高電圧が印加されます。このプロセス中に、i) エレクトロスプレーと ii) 水のイオン化という 2 つの異なる現象が発生します。2 つの電極間の強い電場により、凝縮水の表面に負電荷が蓄積され、テイラー コーンが形成されます。その結果、高電荷の水滴が形成され、レイリー理論16 のように、より小さな粒子に分裂し続けます。同時に、強い電場により、一部の水分子が分裂して電子を剥ぎ取り（イオン化）、大量の活性酸素種（ROS）17 が生成されます。同時に生成された ROS18 は EWNS にカプセル化されました（図 1c）。
図2aは、本研究でEWNS合成に使用されたEWNS生成システムを示しています。密閉ボトルに貯蔵された精製水は、テフロンチューブ（内径2mm）を通して30Gステンレス鋼針（金属毛細管）に供給されます。水の流れは、図2bに示すように、ボトル内の空気圧によって制御されます。針はテフロン製のコンソールに取り付けられており、対向電極から一定の距離に手動で調整できます。対向電極は、中央にサンプリング用の穴が開いた研磨アルミニウムディスクです。対向電極の下にはアルミニウム製のサンプリング漏斗があり、サンプリングポートを介して実験装置の残りの部分に接続されています（図2b）。サンプラーの動作を妨げる可能性のある電荷の蓄積を避けるため、すべてのサンプラーコンポーネントは電気的に接地されています。
（a）人工水ナノ構造生成システム（EWNS）。（b）サンプラーとエレクトロスプレーの断面図。最も重要なパラメータを示す。（c）細菌不活化のための実験装置。
上記のEWNS生成システムは、主要な動作パラメータを変更することで、EWNS特性の微調整を容易にすることができます。印加電圧（V）、針と対向電極間の距離（L）、および毛細管を通る水流量（φ）を調整して、EWNS特性を微調整します。異なる組み合わせを表すために使用される記号：[V（kV）、L（cm）]。特定のセット[V、L]の安定したテイラーコーンを得るために水流量を調整します。この研究の目的のために、対向電極の開口径（D）は0.5インチ（1.29cm）に維持されました。
形状の制約と非対称性のため、電界強度を第一原理から計算することはできません。そこで、QuickField™ソフトウェア（デンマーク、スヴェンボー）19を用いて電界を計算しました。電界は均一ではないため、様々な構成における基準値として、毛細管先端の電界値を用いました。
本研究では、テイラーコーンの形成、テイラーコーンの安定性、EWNS生成の安定性、および再現性の観点から、針と対向電極間の電圧と距離のいくつかの組み合わせを評価した。さまざまな組み合わせを補足表S1に示す。
EWNS生成システムの出力は、粒子数濃度測定のために走査移動度粒子径分析装置（SMPS、モデル3936、TSI、ミネソタ州ショアビュー）とエアロゾルファラデー電位計（TSI、モデル3068B、ミネソタ州ショアビュー）に直接接続されました。エアロゾル電流の測定は、以前の論文で説明した方法で行いました。SMPSとエアロゾル電位計の両方で、0.5 L/minの流量（総サンプル流量1 L/min）でサンプリングを行いました。粒子数濃度とエアロゾル流量は120秒間測定しました。測定は30回繰り返しました。電流測定に基づいて、総エアロゾル電荷を計算し、選択されたEWNS粒子の総数に応じて平均EWNS電荷を推定します。EWNSの平均コストは、式（1）を使用して計算できます。
ここで、IElは測定された電流、NSMPSはSMPSで測定されたデジタル濃度、φElは電位計あたりの流量である。
相対湿度（RH）は表面電荷に影響を与えるため、実験中は温度と相対湿度をそれぞれ21℃と45%に一定に保った。
EWNSのサイズと寿命の測定には、原子間力顕微鏡（AFM）、Asylum MFP-3D（Asylum Research、カリフォルニア州サンタバーバラ）、およびAC260Tプローブ（オリンパス、東京、日本）を使用した。AFMのスキャン周波数は1 Hz、スキャン領域は5 μm × 5 μm、スキャンライン数は256本であった。すべての画像は、Asylumソフトウェア（マスク範囲100 nm、閾値100 pm）を使用して1次画像アライメントを行った。
テスト用漏斗を取り外し、マイカ表面を対向電極から2.0 cmの距離に置き、120秒間平均化して粒子凝集やマイカ表面上の不規則な液滴の形成を防いだ。EWNSは、新たに切断したマイカ（Ted Pella、カリフォルニア州レディング）の表面に直接噴霧した。AFMスパッタリング直後のマイカ表面の画像。新たに切断した未修飾マイカ表面の接触角は0°に近いので、EVNSはマイカ表面にドーム状に分布する。拡散液滴の直径（a）と高さ（h）はAFMトポグラフィーから直接測定し、以前に検証した方法を用いてEWNSドーム拡散体積を計算するために使用した。搭載されているEWNSが同じ体積であると仮定すると、等価直径は式（2）を用いて計算できる。
以前に開発した方法に基づいて、電子スピン共鳴（ESR）スピントラップを使用して、EWNS 中の短寿命ラジカル中間体の存在を検出しました。エアロゾルは、235 mM の DEPMPO(5-(ジエトキシホスホリル)-5-メチル-1-ピロリン-N-オキシド) (Oxis International Inc.、ポートランド、オレゴン) 溶液を含む 650 μm ミジェット スパージャー (Ace Glass、Vineland、NJ) を通してバブリングされました。すべての ESR 測定は、Bruker EMX 分光計 (Bruker Instruments Inc.、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国) とフラット パネル セルを使用して実行されました。データの収集と分析には、Acquisit ソフトウェア (Bruker Instruments Inc.、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国) を使用しました。ROS の特性の決定は、一連の動作条件 [-6.5 kV、4.0 cm] でのみ実行されました。インパクター内でのEWNSの損失を考慮した上で、SMPSを用いてEWNS濃度を測定した。
オゾン濃度は、205デュアルビームオゾンモニター™（2Bテクノロジーズ、コロラド州ボルダー）8,9,10を使用して監視されました。
EWNSのすべての特性について、平均値を測定値として、標準偏差を測定誤差として使用しました。最適化されたEWNS属性の値と、ベースとなるEWNSの対応する値を比較するために、t検定を実施しました。
図2cは、EWNSを表面に標的送達するために使用できる、以前に開発され特性評価された静電沈殿（EPES）「プル」システムを示しています。EPESは、強い電界の影響下でターゲットの表面に直接「誘導」できるEVNS電荷を使用します。EPESシステムの詳細は、Pyrgiotakisらによる最近の論文11で説明されています。EPESは、テーパー状の端部を持つ3DプリントPVCチャンバーで構成され、中央に15.24cm離れた2枚の平行なステンレス鋼（304ステンレス鋼、鏡面コーティング）金属板が含まれています。ボードは外部高電圧源（Bertran 205B-10R、Spellman、Hauppauge、NY）に接続され、下側のプレートは常に正電圧に接続され、上側のプレートは常に接地（フローティング接地）に接続されています。チャンバーの壁は、粒子損失を防ぐために電気的に接地されたアルミホイルで覆われています。このチャンバーには密閉式の前面投入口があり、試験面をプラスチック製のスタンドに設置することで、底部の金属板から試験面を浮かせ、高電圧による干渉を回避できるようになっている。
EPESにおけるEWNSの堆積効率は、補足図S111に詳述されている以前に開発されたプロトコルに従って計算された。
制御室として、2つ目の円筒形フローチャンバーがEPESシステムに直列に接続され、その中間HEPAフィルターを使用してEWNSを除去した。図2cに示すように、EWNSエアロゾルは2つの内蔵チャンバーを通してポンプで送られた。制御室とEPESの間のフィルターは、残留するEWNSを除去し、結果として温度（T）、相対湿度（RH）、オゾン濃度が同じになる。
重要な食品媒介微生物が、糞便指標菌である大腸菌（ATCC #27325）、食品媒介病原菌であるサルモネラ菌（ATCC #53647）、病原性リステリア・モノサイトゲネスの代替菌であるリステリア・ハーモレス（ATCC #33090、ATCC（バージニア州マナサス）由来）、腐敗酵母の代替菌であるサッカロミセス・セレビシエ（ATCC #4098）、およびより耐性の高い不活化細菌であるマイコバクテリウム・パララッキー（ATCC #19686）など、生鮮食品を汚染することがわかっています。
地元の市場で有機栽培のミニトマトを無作為に購入し、使用するまで（最長3日間）4℃で冷蔵保存してください。実験に使用したトマトはすべて同じ大きさで、直径は約1/2インチでした。
培養、接種、曝露、およびコロニー数測定のプロトコルは、以前の出版物および補足データに詳しく記載されています。 EWNS の有効性は、接種したトマトを 40,000 #/cm3 に 45 分間曝露することによって評価されました。簡単に説明すると、3 つのトマトを使用して、t = 0 分時点での生存微生物を評価しました。3 つのトマトを EPES に入れ、40,000 #/cc の EWNS に曝露し (EWNS 曝露トマト)、残りの 3 つはコントロール チャンバーに入れました (コントロール トマト)。両グループのトマトに追加の処理は行いませんでした。EWNS 曝露トマトとコントロール トマトは、45 分後に取り出され、EWNS の効果を評価しました。
各実験は3回ずつ繰り返して実施した。データ解析は補足資料に記載されている手順に従って行った。
不活性化メカニズムは、EWNS サンプル (40,000 #/cm3 EWNS エアロゾル濃度で 45 分間) と、無害な細菌である大腸菌、サルモネラ菌、乳酸菌の非照射サンプルの沈降によって評価されました。粒子は、0.1 M カコジル酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.4) 中の 2.5% グルタルアルデヒド、1.25% パラホルムアルデヒド、0.03% ピクリン酸で室温で 2 時間固定されました。洗浄後、1% 四酸化オスミウム (OsO4)/1.5% フェロシアン化カリウム (KFeCN6) で 2 時間後固定し、水で 3 回洗浄し、1% 酢酸ウラニルで 1 時間インキュベートし、その後水で 2 回洗浄し、50%、70%、90%、100% アルコールで 10 分間脱水しました。次に、サンプルを1時間プロピレンオキシドに浸漬し、プロピレンオキシドとTAAPエポン（Marivac Canada Inc.、カリフォルニア州セントローレント）の1:1混合物を含浸させた。サンプルをTAABエポンに埋め込み、60℃で48時間重合させた。硬化した顆粒状樹脂を切断し、AMT 2k CCDカメラ（Advanced Microscopy Techniques, Corp.、マサチューセッツ州ウォーバーン、米国）を搭載した従来の透過型電子顕微鏡JEOL 1200EX（日本電子、東京、日本）を用いてTEMで観察した。
すべての実験は3回繰り返して実施した。各時点において、細菌洗浄液を3回ずつ接種し、1時点あたり合計9つのデータポイントを得た。これらの平均値を、その特定の微生物の細菌濃度とした。標準偏差を測定誤差として用いた。すべてのデータポイントを有効とした。
t = 0分と比較した細菌濃度の減少の対数は、以下の式を用いて計算した。
ここで、C0は時間0（つまり、表面が乾燥した後、チャンバーに入れる前）における対照サンプル中の細菌濃度であり、Cnはn分間の暴露後の表面上の細菌濃度である。
45分間の曝露中に細菌が自然に分解されることを考慮するため、45分後の対照群と比較した対数減少率も以下のように計算した。
ここで、Cnは時間nにおける対照サンプル中の細菌濃度、Cn-Controlは時間nにおける対照細菌濃度である。データは対照（EWNS曝露なし）と比較した対数減少として示されている。
本研究では、テイラーコーン形成、テイラーコーンの安定性、EWNS生成の安定性、再現性の観点から、針と対向電極間の電圧と距離のいくつかの組み合わせを評価した。さまざまな組み合わせを補足表S1に示す。安定性と再現性のある特性（テイラーコーン、EWNS生成、および時間経過に伴う安定性）を示す2つのケースを包括的な研究のために選択した。図3には、両方のケースにおけるROSの電荷、サイズ、および含有量の結果を示す。結果は表1にもまとめられている。参考として、図3と表1の両方には、以前に合成された最適化されていないEWNS8、9、10、11（ベースラインEWNS）の特性も含まれている。両側t検定を使用した統計的有意性の計算は、補足表S2に再掲載されている。さらに、追加データには、対向電極サンプリング穴の直径（D）と接地電極とチップ間の距離（L）の影響に関する研究が含まれる（補足図S2およびS3）。
(ac) AFMで測定したサイズ分布。(df) 表面電荷特性。(g) EPRのROS特性評価。
また、上記のすべての条件において、測定されたイオン化電流は2～6μA、電圧は-3.8～-6.5kVであり、この単一のEWNS生成コンタクトモジュールの消費電力は50mW未満であったことも重要です。EWNSは高圧下で合成されましたが、オゾン濃度は非常に低く、60ppbを超えることはありませんでした。
補足図S4は、それぞれ[-6.5 kV、4.0 cm]と[-3.8 kV、0.5 cm]のシナリオにおけるシミュレーションされた電界を示しています。[-6.5 kV、4.0 cm]と[-3.8 kV、0.5 cm]のシナリオにおける電界の計算値は、それぞれ2 × 10⁵ V/mと4.7 × 10⁵ V/mです。これは、後者の場合の方が電圧と距離の比がはるかに高いため、予想された結果です。
図3a、bはAFM8で測定したEWNSの直径を示しています。計算された平均EWNS直径は、[-6.5 kV、4.0 cm]と[-3.8 kV、0.5 cm]のスキームでそれぞれ27 nmと19 nmでした。[-6.5 kV、4.0 cm]と[-3.8 kV、0.5 cm]のシナリオでは、分布の幾何標準偏差はそれぞれ1.41と1.45であり、狭いサイズ分布を示しています。平均サイズと幾何標準偏差はどちらも、ベースラインEWNSの25 nmと1.41に非常に近い値です。図3cは、同じ方法で同じ条件で測定したベースEWNSのサイズ分布を示しています。
図 3d、e には電荷特性評価の結果が示されています。データは濃度 (#/cm3) と電流 (I) の 30 回の同時測定の平均値です。分析によると、EWNS の平均電荷は、[-6.5 kV、4.0 cm] と [-3.8 kV、0.5 cm] でそれぞれ 22 ± 6 e- と 44 ± 6 e- です。これらはベースライン EWNS (10 ± 2 e-) と比較して表面電荷が著しく高く、[-6.5 kV、4.0 cm] シナリオの 2 倍、[-3.8 kV、0.5 cm] の 4 倍です。図 3f はベースライン EWNS の電荷データを示しています。
EWNS数の濃度マップ（補足図S5およびS6）から、[-6.5 kV、4.0 cm]シナリオでは[-3.8 kV、0.5 cm]シナリオよりも粒子数が著しく多いことがわかります。また、EWNS数の濃度は最大4時間までモニタリングされており（補足図S5およびS6）、EWNS生成の安定性はどちらの場合も同じレベルの粒子数濃度を示していることも注目に値します。
図3gには、[-6.5 kV、4.0 cm]で最適化されたEWNSコントロール（バックグラウンド）を差し引いた後のEPRスペクトルが示されています。ROSスペクトルは、以前に発表された研究のベースラインEWNSシナリオとも比較されました。スピントラップと反応するEWNSの数は7.5 × 104 EWNS/sと計算され、これは以前に発表されたベースラインEWNS8と同様です。EPRスペクトルは、2種類のROSの存在を明確に示しており、O2-が主要な種であり、OH•はそれほど多くありません。さらに、ピーク強度の直接比較により、最適化されたEWNSはベースラインEWNSと比較してROS含有量が著しく高いことがわかりました。
図4は、EPESにおけるEWNSの堆積効率を示しています。データは表Iにもまとめられており、元のEWNSデータと比較されています。EUNSのどちらの場合も、3.0 kVという低電圧でも堆積率は100%に近くなっています。通常、表面電荷の変化に関わらず、3.0 kVで100%の堆積が可能です。同じ条件下では、Baseline-EWNSの堆積効率は、電荷が低い（EWNSあたり平均10電子）ため、わずか56%でした。
図5および表2には、最適モード[-6.5 kV、4.0 cm]で約40,000 #/cm3 EWNSに45分間曝露した後のトマト表面に接種された微生物の不活化値がまとめられています。接種されたE. coliとLactobacillus innocuousは、45分間の曝露中に3.8 logの有意な減少を示しました。同じ条件下で、S. entericaは2.2 log減少し、S. cerevisiaeとM. parafortutumは1.0 log減少しました。
電子顕微鏡写真（図6）は、EWNSが無害な大腸菌、連鎖球菌、乳酸菌の細胞に引き起こす物理的変化を示しており、これらの細菌の不活化につながっている。対照群の細菌は細胞膜が損傷を受けていなかったが、曝露された細菌は外膜が損傷を受けていた。
対照群および曝露群の細菌を電子顕微鏡で観察したところ、細胞膜の損傷が明らかになった。
最適化された EWNS の物理化学的特性に関するデータは、EWNS の特性 (表面電荷と ROS 含有量) が、以前に発表された EWNS のベースライン データ 8,9,10,11 と比較して大幅に改善されたことを総合的に示しています。一方、そのサイズはナノメートル範囲に留まり、以前に報告された結果と非常によく似ており、長時間空気中に留まることができます。観察された多分散性は、EWNS のサイズを決定する表面電荷の変化、レイリー効果のランダム性、および潜在的な合体によって説明できます。しかし、Nielsen ら 22 が詳述しているように、高い表面電荷は、水滴の表面エネルギー/張力を効果的に増加させることにより蒸発を減少させます。以前の論文 8 では、この理論はマイクロドロップレット 22 と EWNS について実験的に確認されています。時間の経過に伴う電荷の損失もサイズに影響を与え、観察されたサイズ分布に寄与する可能性があります。
さらに、構造あたりの電荷は状況によって約 22〜44 e- であり、構造あたり平均電荷が 10 ± 2 電子である基本的な EWNS と比較してかなり高い。ただし、これは EWNS の平均電荷であることに注意する必要がある。Seto らは、電荷が不均一であり、対数正規分布に従うことを示した 21。我々の以前の研究と比較すると、表面電荷を 2 倍にすると、EPES システムの堆積効率がほぼ 100% に 2 倍になる 11。