Köszönjük, hogy felkereste a Nature.com weboldalt. Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik. A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy egy frissített böngészőt használjon (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Időközben a folyamatos támogatás biztosítása érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
Nemrégiben kifejlesztettek egy vegyszermentes antimikrobiális platformot, amely a mesterséges víz nanostruktúrákat (EWNS) használó nanotechnológián alapul. Az EWNS-ek nagy felületi töltéssel rendelkeznek, és reaktív oxigénfajokkal (ROS) telítettek, amelyek számos mikroorganizmussal, köztük az élelmiszerekben található kórokozókkal is kölcsönhatásba léphetnek és inaktiválhatják azokat. Itt bemutatjuk, hogy tulajdonságaik a szintézis során finomhangolhatók és optimalizálhatók antibakteriális potenciáljuk további fokozása érdekében. Az EWNS laboratóriumi platformot úgy tervezték, hogy a szintézis paramétereinek változtatásával finomhangolja az EWNS tulajdonságait. Az EWNS tulajdonságainak jellemzése (töltés, méret és ROS-tartalom) modern analitikai módszerekkel. Ezenkívül értékelték mikrobiális inaktivációs potenciáljukat az élelmiszerekben található mikroorganizmusokkal, például az Escherichia colival, a Salmonella enterica-val, a Listeria innocuous-szal, a Mycobacterium paraaccidentum-mal és a Saccharomyces cerevisiae-vel szemben. Az itt bemutatott eredmények azt mutatják, hogy az EWNS tulajdonságai finomhangolhatók a szintézis során, ami az inaktivációs hatékonyság exponenciális növekedését eredményezi. Különösen a felületi töltés négyszeresére nőtt, és a reaktív oxigénfajok mennyisége is megnőtt. A mikrobiális eltávolítási sebesség mikrobiálisan függött, és 1,0 és 3,8 log között mozgott 45 perces 40 000 #/cc EWNS aeroszol dózisú expozíció után.
A kórokozók vagy azok toxinjainak lenyelése által okozott élelmiszer eredetű betegségek fő oka a mikrobiális szennyezés. Csak az Egyesült Államokban az élelmiszer eredetű betegségek évente körülbelül 76 millió megbetegedést, 325 000 kórházi felvételt és 5000 halálesetet okoznak1. Ezenkívül az Egyesült Államok Mezőgazdasági Minisztériuma (USDA) becslései szerint a friss termékek fokozott fogyasztása felelős az Egyesült Államokban jelentett összes élelmiszer eredetű betegség 48%-áért2. Az élelmiszer eredetű kórokozók okozta betegségek és halálesetek költsége az Egyesült Államokban nagyon magas, a Betegségellenőrzési és Megelőzési Központok (CDC) becslése szerint több mint 15,6 milliárd USD évente3.
Jelenleg az élelmiszer-biztonság garantálását célzó kémiai,4, sugárzásos5 és termikus6 antimikrobiális beavatkozásokat többnyire a termelési lánc korlátozott kritikus ellenőrzési pontjain (CCP-ken) végzik (általában a betakarítás után és/vagy a csomagolás során), ahelyett, hogy folyamatosan végeznék őket. Így hajlamosak a keresztszennyeződésre. 7. Az élelmiszer eredetű betegségek és az élelmiszer-romlás jobb ellenőrzése olyan antimikrobiális beavatkozásokat igényel, amelyek potenciálisan a gazdaságtól az asztalig tartó folyamatban alkalmazhatók, miközben csökkentik a környezeti hatásokat és a költségeket.
Nemrégiben kifejlesztettek egy vegyszermentes, nanotechnológián alapuló antimikrobiális platformot, amely mesterséges víz nanostruktúrák (EWNS) segítségével képes inaktiválni a felszíni és levegőben lévő baktériumokat. Az EWNS-t két párhuzamos eljárással, elektrospray-vel és vízionizációval szintetizálták (1a. ábra). Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az EWNS-ek egyedi fizikai és biológiai tulajdonságokkal rendelkeznek8,9,10. Az EWNS-ek átlagosan 10 elektronnal rendelkeznek szerkezetenként, és átlagos nanoskálájú méretük 25 nm (1b.,c. ábra)8,9,10. Ezenkívül az elektronspin-rezonancia (ESR) kimutatta, hogy az EWNS nagy mennyiségű reaktív oxigénfajtát (ROS) tartalmaz, főként hidroxil- (OH•) és szuperoxid (O2-) gyököket (1c. ábra)8. Az EVNS hosszú ideig a levegőben van, és ütközhet a levegőben lebegő és a felszínen jelen lévő mikroorganizmusokkal, leadva ROS-hasznos terhelésüket és a mikroorganizmusok inaktiválását okozva (1d. ábra). Ezek a korai tanulmányok azt is kimutatták, hogy az EWNS kölcsönhatásba léphet és inaktiválhatja a különféle Gram-negatív és Gram-pozitív baktériumokat, beleértve a mikobaktériumokat is, felületeken és a levegőben. A transzmissziós elektronmikroszkópia kimutatta, hogy az inaktivációt a sejtmembrán károsodása okozta. Ezenkívül az akut inhalációs vizsgálatok kimutatták, hogy az EWNS nagy dózisai nem okoznak tüdőkárosodást vagy gyulladást8.
(a) Az elektrosztatikus porlasztás akkor következik be, amikor nagyfeszültséget alkalmaznak egy folyadékot tartalmazó kapilláris cső és egy ellenelektróda között. (b) A nagy nyomás alkalmazása két különböző jelenséget eredményez: (i) a víz elektrosztatikus porlasztását és (ii) reaktív oxigénfajták (ionok) képződését, amelyek az EWNS-ben csapdába esnek. (c) Az EWNS-ek egyedi szerkezete. (d) Nanoskálájú jellegük miatt az EWNS-ek rendkívül mozgékonyak, és kölcsönhatásba léphetnek a levegőben lévő kórokozókkal.
Az EWNS antimikrobiális platform azon képességét is nemrégiben igazolták, hogy képes inaktiválni az élelmiszerekben élő mikroorganizmusokat a friss élelmiszerek felületén. Azt is kimutatták, hogy az EWNS felületi töltése elektromos mezővel kombinálva célzott hatóanyag-leadást tesz lehetővé. Ezenkívül a bioparadicsomok előzetes eredményei 90 perces, körülbelül 50 000 #/cm3 EWNS-expozíció után biztatóak voltak, különféle élelmiszerekben élő mikroorganizmusokat, például az E. colit és a Listeria 11-et figyeltek meg. Ezenkívül az előzetes érzékszervi vizsgálatok nem mutattak érzékszervi hatásokat a kontrollparadicsomokhoz képest. Bár ezek a kezdeti inaktivációs eredmények biztatóak az élelmiszer-biztonsági alkalmazások szempontjából még nagyon alacsony, 50 000 #/cm3-es EWNS-dózisok esetén is, egyértelmű, hogy a magasabb inaktivációs potenciál előnyösebb lenne a fertőzés és a romlás kockázatának további csökkentése érdekében.
Kutatásunkat itt egy EWNS generációs platform fejlesztésére fogjuk összpontosítani, amely lehetővé teszi a szintézisparaméterek finomhangolását és az EWNS fizikai-kémiai tulajdonságainak optimalizálását antibakteriális potenciáljuk fokozása érdekében. Az optimalizálás különösen a felületi töltésűek (a célzott célba jutás javítása) és a ROS-tartalom (az inaktivációs hatékonyság javítása) növelésére összpontosított. Az optimalizált fizikai-kémiai tulajdonságokat (méret, töltés és ROS-tartalom) modern analitikai módszerekkel jellemezzük, és olyan gyakori élelmiszer-mikroorganizmusokat használunk, mint az E.
Az EVNS-t nagy tisztaságú víz (18 MΩ cm–1) egyidejű elektroporlasztásával és ionizációjával szintetizálták. Az elektromos porlasztót 12 jellemzően folyadékok porlasztására, valamint szabályozott méretű polimer és kerámia részecskék 13 és szálak 14 szintézisére használják.
Amint azt a korábbi publikációkban (8, 9, 10, 11) részletesen ismertettük, egy tipikus kísérletben nagyfeszültséget alkalmaztak egy fémkapilláris és egy földelt ellenelektróda között. A folyamat során két különböző jelenség játszódik le: i) elektrosztatikus porlasztás és ii) vízionizáció. A két elektróda közötti erős elektromos mező negatív töltések felhalmozódását okozza a kondenzvíz felületén, ami Taylor-kúpok kialakulásához vezet. Ennek eredményeként erősen töltött vízcseppek keletkeznek, amelyek továbbra is kisebb részecskékre esnek szét, ahogy a Rayleigh-elméletben16 szerepel. Ugyanakkor az erős elektromos mezők egyes vízmolekulák felhasadását és elektronok leadását (ionizációt) okoznak, ami nagyszámú reaktív oxigénfaj (ROS)17 képződéséhez vezet. Az egyidejűleg keletkezett ROS18-at EWNS-be kapszulázták (1c. ábra).
A 2a. ábra az ebben a tanulmányban kifejlesztett és az EWNS szintézisben használt EWNS generáló rendszert mutatja. Egy zárt palackban tárolt tisztított vizet egy teflon csövön (2 mm belső átmérőjű) keresztül egy 30G-os rozsdamentes acél tűbe (fém kapilláris) vezettek. A víz áramlását a palackban lévő légnyomás szabályozza, ahogy a 2b. ábra mutatja. A tű egy teflon konzolra van szerelve, és manuálisan beállítható egy bizonyos távolságra az ellenelektródától. Az ellenelektróda egy polírozott alumínium korong, amelynek közepén egy lyuk van a mintavételhez. Az ellenelektróda alatt egy alumínium mintavevő tölcsér található, amely egy mintavételi nyíláson keresztül csatlakozik a kísérleti összeállítás többi részéhez (2b. ábra). A mintavevő működését megzavaró töltésfelhalmozódás elkerülése érdekében a mintavevő összes alkatrésze elektromosan földelt.
(a) Mesterséges Víz Nanoszerkezet Generáló Rendszer (EWNS). (b) A mintavevő és az elektroporlasztás keresztmetszete, a legfontosabb paraméterekkel. (c) Kísérleti beállítás baktériumok inaktiválására.
A fent leírt EWNS generáló rendszer képes a kulcsfontosságú működési paraméterek megváltoztatására az EWNS tulajdonságainak finomhangolásának megkönnyítése érdekében. Az alkalmazott feszültség (V), a tű és az ellenelektróda közötti távolság (L), valamint a kapillárison átfolyó víz áramlási sebességének (φ) beállítása az EWNS jellemzőinek finomhangolásához. A különböző kombinációk jelölésére használt szimbólum: [V (kV), L (cm)]. Állítsa be a víz áramlási sebességét egy bizonyos halmaz [V, L] stabil Taylor-kúpjának eléréséhez. A vizsgálat céljából az ellenelektróda nyílásátmérőjét (D) 0,5 hüvelyken (1,29 cm) tartottuk.
A korlátozott geometria és aszimmetria miatt az elektromos térerősség nem számítható ki az elsődleges elvek alapján. Ehelyett a QuickField™ szoftvert (Svendborg, Dánia)19 használtuk az elektromos tér kiszámításához. Az elektromos tér nem egyenletes, ezért a kapilláris csúcsán lévő elektromos tér értékét használtuk referenciaértékként a különböző konfigurációkhoz.
A vizsgálat során a feszültség és a tű, valamint az ellenelektróda közötti távolság számos kombinációját értékelték a Taylor-kúp kialakulása, a Taylor-kúp stabilitása, az EWNS-termelés stabilitása és a reprodukálhatóság szempontjából. A különböző kombinációkat az S1. kiegészítő táblázat mutatja.
Az EWNS generáló rendszer kimenetét közvetlenül egy Scanning Mobility Particle Size Analyzerhez (SMPS, Model 3936, TSI, Shoreview, MN) csatlakoztattuk a részecskeszám-koncentráció méréséhez, valamint egy Aerosol Faraday Electrometerhez (TSI, Model 3068B, Shoreview, MN). Az aeroszoláramok mérése a korábbi publikációnkban leírtak szerint történt. Mind az SMPS, mind az aeroszol elektrométer mintavételezése 0,5 L/perc áramlási sebességgel történt (teljes mintaáramlás 1 L/perc). A részecskék számkoncentrációját és az aeroszol áramlását 120 másodpercig mértük. A mérést 30-szor megismételtük. Az árammérések alapján kiszámítottuk a teljes aeroszol töltetet, és becsültük az átlagos EWNS töltetet a kiválasztott EWNS részecskék adott teljes számára vonatkozóan. Az EWNS átlagos költsége az (1) egyenlettel számítható ki:
ahol az IEl a mért áramerősség, az NSMPS az SMPS-sel mért digitális koncentráció, és φEl az elektrométerenkénti áramlási sebesség.
Mivel a relatív páratartalom (RH) befolyásolja a felületi töltést, a kísérlet során a hőmérsékletet és a (RH) értéket állandó értéken, 21°C-on, illetve 45%-on tartottuk.
Az EWNS méretének és élettartamának mérésére atomerő-mikroszkópiát (AFM), Asylum MFP-3D-t (Asylum Research, Santa Barbara, Kalifornia) és AC260T szondát (Olympus, Tokió, Japán) használtunk. Az AFM pásztázási frekvencia 1 Hz, a pásztázási terület 5 μm × 5 μm és 256 pásztázási vonal volt. Minden képet elsőrendű képillesztésnek vetettünk alá Asylum szoftver segítségével (maszktartomány 100 nm, küszöbérték 100 pm).
A teszttölcsért eltávolítottuk, és a csillámfelületet 2,0 cm távolságra helyeztük az ellenelektródától 120 másodperces átlagolási időre, hogy elkerüljük a részecskék agglomerációját és a szabálytalan cseppek képződését a csillámfelületen. Az EWNS-t közvetlenül a frissen vágott csillám felületére permeteztük (Ted Pella, Redding, CA). A csillámfelület képe közvetlenül az AFM porlasztás után. A frissen vágott, módosítatlan csillám felületének érintkezési szöge közel 0°, így az EVNS kupola formájában oszlik el a csillámfelületen. A diffundáló cseppek átmérőjét (a) és magasságát (h) közvetlenül az AFM topográfiából mértük, és az EWNS kupolás diffúziós térfogatának kiszámításához használtuk fel a korábban validált módszerünkkel. Feltételezve, hogy a fedélzeti EWNS azonos térfogatú, az ekvivalens átmérő a (2) egyenlettel számítható ki:
Korábban kidolgozott módszerünk alapján elektronspin-rezonancia (ESR) spincsapdát alkalmaztunk a rövid élettartamú gyökös intermedierek jelenlétének kimutatására az EWNS-ben. Az aeroszolokat egy 650 μm-es Midget-szórófejen (Ace Glass, Vineland, NJ) buborékoltattuk át, amely 235 mM DEPMPO(5-(dietoxi-foszforil)-5-metil-1-pirrolin-N-oxid) (Oxis International Inc.) oldatot tartalmazott. Portland, Oregon). Minden ESR-mérést Bruker EMX spektrométerrel (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) és egy síkpaneles cellával végeztünk. Az adatok gyűjtésére és elemzésére az Acquisit szoftvert (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) használtuk. A ROS jellemzőinek meghatározását csak egy üzemi körülménykészletre [-6,5 kV, 4,0 cm] végeztük. Az EWNS-koncentrációkat SMPS-sel mértük, miután figyelembe vettük az impaktorban az EWNS-veszteségeket.
Az ózonszintet egy 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Colorado) készülékkel monitorozták8,9,10.
Minden EWNS tulajdonság esetében az átlagértéket használtuk mérési értékként, a szórást pedig mérési hibaként. T-próbákat végeztünk az optimalizált EWNS attribútumok értékeinek az alap EWNS megfelelő értékeivel való összehasonlítására.
A 2c. ábra egy korábban kifejlesztett és jellemzett elektrosztatikus kicsapási (EPES) „húzó” rendszert mutat be, amely az EWNS célzott felszíni célzott leadására használható. Az EPES EVNS töltéseket használ, amelyek erős elektromos tér hatására közvetlenül a célpont felületére „vezethetők”. Az EPES rendszer részleteit Pyrgiotakis és munkatársai 11 nemrégiben megjelent publikációja mutatja be. Így az EPES egy 3D nyomtatott PVC kamrából áll, kúpos végekkel, és két párhuzamos rozsdamentes acél (304 rozsdamentes acél, tükörbevonatú) fémlapot tartalmaz középen, 15,24 cm távolságra egymástól. A lapokat egy külső nagyfeszültségű forráshoz (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY) csatlakoztatták, az alsó lemez mindig pozitív feszültséghez, a felső lemez pedig mindig földhöz (lebegő földhöz) volt csatlakoztatva. A kamra falait alumíniumfóliával borítják, amely elektromosan földelt a részecskeveszteség megakadályozása érdekében. A kamra egy lezárt elülső betöltőajtóval rendelkezik, amely lehetővé teszi a tesztfelületek műanyag állványokra helyezését, amelyek az alsó fémlemez fölé emelik őket, hogy elkerüljék a nagyfeszültségű interferenciát.
Az EWNS lerakódási hatékonyságát az EPES-ben egy korábban kidolgozott, az S111. kiegészítő ábrán részletezett protokoll szerint számítottuk ki.
Vezérlőkamraként egy második hengeres áramlási kamrát sorba kötöttek az EPES rendszerhez, amelyben egy közbenső HEPA szűrőt használtak az EWNS eltávolítására. Amint a 2c. ábrán látható, az EWNS aeroszolt két beépített kamrán keresztül pumpálták. A vezérlőhelyiség és az EPES közötti szűrő eltávolítja a maradék EWNS-t, ami azonos hőmérsékletet (T), relatív páratartalmat (RH) és ózonszintet eredményezett.
Fontos, élelmiszer eredetű mikroorganizmusokról találtak friss élelmiszereket szennyező baktériumokat, mint például az E. coli (ATCC #27325), a széklet indikátor, a Salmonella enterica (ATCC #53647), az élelmiszer eredetű kórokozó, a Listeria harmless (ATCC #33090), a patogén Listeria monocytogenes helyettesítője, amelyet az ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) törzsből származtattak, és a romlást okozó élesztő helyettesítője, valamint egy rezisztensebb inaktivált baktérium, a Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Vásárolj véletlenszerű mennyiségű bio koktélparadicsomot a helyi piacon, és felhasználásig (legfeljebb 3 napig) tedd hűtőbe 4°C-ra. A kísérleti paradicsomok mind azonos méretűek voltak, körülbelül 1,5 cm átmérőjűek.
A tenyésztési, beoltási, expozíciós és telepszámlálási protokollokat korábbi publikációnkban és a Kiegészítő Adatokban részletesen ismertetjük. Az EWNS hatékonyságát úgy értékeltük, hogy a beoltott paradicsomokat 40 000 #/cm3 koncentrációnak tették ki 45 percig. Röviden, három paradicsomot használtunk a túlélő mikroorganizmusok értékelésére a t = 0 perc időpontban. Három paradicsomot helyeztünk EPES-be, és 40 000 #/cm3 koncentrációjú EWNS-nek tettük ki (EWNS-nek kitett paradicsomok), a fennmaradó hármat pedig a kontrollkamrába helyeztük (kontroll paradicsomok). Mindkét csoportban a paradicsomok további feldolgozását nem végeztük el. Az EWNS-nek kitett paradicsomokat és a kontroll paradicsomokat 45 perc elteltével eltávolítottuk az EWNS hatásának értékelése céljából.
Minden kísérletet háromszor végeztünk. Az adatelemzést a Kiegészítő Adatokban leírt protokoll szerint végeztük.
Az inaktivációs mechanizmusokat kitett EWNS minták (45 perc 40 000 #/cm3 EWNS aeroszol koncentrációnál) és nem besugárzott ártalmatlan E. coli, Salmonella enterica és Lactobacillus baktérium minták ülepítésével értékelték. A részecskéket 2,5%-os glutaraldehidben, 1,25%-os paraformaldehidben és 0,03%-os pikrinsavban fixálták 0,1 M nátrium-kakodilát pufferben (pH 7,4) 2 órán át szobahőmérsékleten. Mosás után 1%-os ozmium-tetroxiddal (OsO4)/1,5%-os kálium-ferrocianiddal (KFeCN6) utófixálták 2 órán át, majd háromszor mosták vízzel, és 1 órán át 1%-os uranil-acetátban inkubálták, végül kétszer mosták vízzel, végül 10 percig dehidratálták 50%-os, 70%-os, 90%-os és 100%-os alkoholban. A mintákat ezután 1 órára propilén-oxidba helyeztük, majd propilén-oxid és TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA) 1:1 arányú keverékével impregnáltuk. A mintákat TAAB Eponba ágyaztuk, és 60°C-on 48 órán át polimerizáltuk. A kikeményedett granuláris gyantát felvágtuk és TEM-mel vizualizáltuk egy hagyományos transzmissziós elektronmikroszkóp, a JEOL 1200EX (JEOL, Tokió, Japán) segítségével, amely egy AMT 2k CCD kamerával (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, USA) volt felszerelve.
Minden kísérletet háromszor végeztünk. Minden időponthoz háromszor vittük be a baktériummosó oldatokat, így pontonként összesen kilenc adatpontot kaptunk, amelyek átlagát használtuk az adott mikroorganizmus baktériumkoncentrációjaként. A szórást használtuk mérési hibaként. Minden pont számít.
A baktériumok koncentrációjának t = 0 perchez viszonyított csökkenésének logaritmusát a következő képlettel számítottuk ki:
ahol C0 a kontrollminta baktériumkoncentrációja a 0. időpontban (azaz miután a felület megszáradt, de még a kamrába helyezése előtt), Cn pedig a baktériumok koncentrációja a felületen n perc expozíció után.
A baktériumok 45 perces expozíció alatti természetes lebomlásának figyelembevételével a kontrollhoz viszonyított logaritmikus csökkenést 45 perc elteltével a következőképpen számítottuk ki:
ahol Cn a kontrollmintában lévő baktériumok koncentrációja n időpontban, és Cn-Control a kontrollbaktériumok koncentrációja n időpontban. Az adatokat a kontrollhoz (EWNS-expozíció nélkül) képest logaritmikus csökkenésként adjuk meg.
A vizsgálat során a tű és az ellenelektróda közötti feszültség és távolság számos kombinációját értékelték a Taylor-kúp kialakulása, a Taylor-kúp stabilitása, az EWNS-termelés stabilitása és a reprodukálhatóság szempontjából. A különböző kombinációkat az S1. kiegészítő táblázat mutatja be. Két, stabil és reprodukálható tulajdonságokat mutató esetet (Taylor-kúp, EWNS-képződés és stabilitás az idő múlásával) választottak ki az átfogó vizsgálathoz. A 3. ábra a ROS töltésére, méretére és tartalmára vonatkozó eredményeket mutatja mindkét esetben. Az eredményeket az 1. táblázat is összefoglalja. Referenciaként mind a 3. ábra, mind az 1. táblázat tartalmazza a korábban szintetizált, nem optimalizált EWNS8, 9, 10, 11 (alap-EWNS) tulajdonságait. A kétoldalú t-próbával végzett statisztikai szignifikancia-számításokat az S2. kiegészítő táblázatban közöljük újra. Ezenkívül további adatok is tartalmaznak az ellenelektróda mintavételi furatátmérőjének (D) és a földelektróda és a csúcs közötti távolságnak (L) a hatását vizsgáló tanulmányokat (S2. és S3. kiegészítő ábrák).
(ac) AFM-mel mért méreteloszlás. (df) Felületi töltés karakterisztikája. (g) Az EPR ROS jellemzése.
Fontos megjegyezni azt is, hogy a fenti körülmények mindegyike mellett a mért ionizációs áram 2 és 6 μA, a feszültség pedig -3,8 és -6,5 kV között volt, ami kevesebb mint 50 mW energiafogyasztást eredményezett ennek az egyetlen EWNS-generáló kontaktmodulnak. Bár az EWNS-t nagy nyomás alatt szintetizálták, az ózonszint nagyon alacsony volt, soha nem haladta meg a 60 ppb-t.
Az S4. kiegészítő ábra a [-6,5 kV, 4,0 cm] és [-3,8 kV, 0,5 cm] forgatókönyvek esetén szimulált elektromos mezőket mutatja. A [-6,5 kV, 4,0 cm] és [-3,8 kV, 0,5 cm] forgatókönyvek esetén a mezőszámítások 2 × 10⁶ V/m, illetve 4,7 × 10⁶ V/m értékeket adnak. Ez várható, mivel a második esetben a feszültség-távolság arány sokkal magasabb.
A 3a, b ábra az AFM8-cal mért EWNS átmérőt mutatja. A számított átlagos EWNS átmérők 27 nm és 19 nm voltak a [-6,5 kV, 4,0 cm] és a [-3,8 kV, 0,5 cm] sémák esetében. A [-6,5 kV, 4,0 cm] és [-3,8 kV, 0,5 cm] forgatókönyvek esetén az eloszlások geometriai szórása 1,41, illetve 1,45, ami szűk méreteloszlást jelez. Mind az átlagos méret, mind a geometriai szórás nagyon közel van az alap EWNS-hez, 25 nm-nél, illetve 1,41-nél. A 3c ábra az alap EWNS méreteloszlását mutatja, ugyanazon módszerrel, azonos körülmények között mérve.
A 3d,e ábrán a töltésjellemzés eredményei láthatók. Az adatok 30 egyidejű koncentrációmérés (#/cm3) és áramerősség (I) átlagértékei. Az elemzés azt mutatja, hogy az EWNS átlagos töltése 22 ± 6 e- és 44 ± 6 e- [-6,5 kV, 4,0 cm], illetve [-3,8 kV, 0,5 cm] esetén. Jelentősen magasabb felületi töltésekkel rendelkeznek az alap EWNS-hez képest (10 ± 2 e-), ami kétszerese a [-6,5 kV, 4,0 cm] forgatókönyvnek, és négyszerese a [-3,8 kV, 0,5 cm]-nek. A 3f ábra az alap EWNS töltésadatait mutatja.
Az EWNS-szám koncentrációtérképeiből (S5. és S6. kiegészítő ábrák) látható, hogy a [-6,5 kV, 4,0 cm] forgatókönyvben szignifikánsan több részecske van, mint a [-3,8 kV, 0,5 cm] forgatókönyvben. Azt is érdemes megjegyezni, hogy az EWNS-szám koncentrációját 4 órán át figyelték (S5. és S6. kiegészítő ábrák), ahol az EWNS-generálás stabilitása mindkét esetben azonos részecskeszám-koncentrációs szinteket mutatott.
A 3g. ábra az optimalizált EWNS kontroll (háttér) levonása utáni EPR spektrumot mutatja [-6,5 kV, 4,0 cm]. A ROS spektrumokat egy korábban publikált munkában szereplő Baseline-EWNS szcenárióval is összehasonlították. A spincsapdákkal reagáló EWNS-ek számát 7,5 × 104 EWNS/s-nak számították, ami hasonló a korábban publikált Baseline-EWNS8-hoz. Az EPR spektrumok egyértelműen kétféle ROS jelenlétét mutatták, ahol az O2- volt a domináns faj, az OH• pedig kevésbé volt jelen. Ezenkívül a csúcsintenzitások közvetlen összehasonlítása azt mutatta, hogy az optimalizált EWNS szignifikánsan magasabb ROS-tartalommal rendelkezett az alap EWNS-hez képest.
A 4. ábra az EWNS leválasztási hatékonyságát mutatja EPES-ben. Az adatokat az I. táblázatban összegeztük és összehasonlítottuk az eredeti EWNS adatokkal. Mindkét EUNS esetben a leválasztás közel 100%-os, még 3,0 kV-os alacsony feszültségen is. Általában 3,0 kV elegendő a 100%-os leválasztáshoz, függetlenül a felületi töltésváltozástól. Ugyanezen körülmények között az alap-EWNS leválasztási hatékonysága mindössze 56% volt az alacsonyabb töltésük miatt (átlagosan 10 elektron EWNS-enként).
Az 5. ábra és a 2. táblázat összefoglalja a paradicsom felületére beoltott mikroorganizmusok inaktivációs értékét, miután a mikroorganizmusokat 45 percig optimális módban [-6,5 kV, 4,0 cm] körülbelül 40 000 #/cm3 EWNS-sel kezelték. A beoltott E. coli és Lactobacillus innocuous törzsek szignifikáns, 3,8 logaritmikus csökkenést mutattak a 45 perces expozíció során. Ugyanezen körülmények között az S. enterica 2,2 logaritmikus, míg az S. cerevisiae és az M. parafortutum 1,0 logaritmikus csökkenést mutatott.
Az elektronmikroszkópos felvételek (6. ábra) az EWNS által ártalmatlan Escherichia coli, Streptococcus és Lactobacillus sejteken kiváltott fizikai változásokat ábrázolják, amelyek azok inaktiválódásához vezettek. A kontrollbaktériumok ép sejtmembránokkal rendelkeztek, míg a kitett baktériumok külső membránjai sérültek voltak.
A kontroll és az exponált baktériumok elektronmikroszkópos képalkotása membránkárosodást mutatott.
Az optimalizált EWNS fizikai-kémiai tulajdonságaira vonatkozó adatok együttesen azt mutatják, hogy az EWNS tulajdonságai (felületi töltés és ROS-tartalom) jelentősen javultak a korábban publikált EWNS alapadatokhoz képest8,9,10,11. Másrészt méretük nanométeres tartományban maradt, ami nagyon hasonlít a korábban közölt eredményekhez, lehetővé téve számukra, hogy hosszú ideig a levegőben maradjanak. A megfigyelt polidiszperzitás magyarázható az EWNS méretét meghatározó felületi töltésváltozásokkal, a Rayleigh-effektus véletlenszerűségével és a potenciális koaleszcencia kialakulásával. Azonban, ahogy Nielsen és munkatársai22 részletezik, a nagy felületi töltés csökkenti a párolgást azáltal, hogy hatékonyan növeli a vízcsepp felületi energiáját/feszültségét. Korábbi publikációnkban8 ezt az elméletet kísérletileg is megerősítettük mikrocseppek22 és EWNS esetében. Az idő múlásával bekövetkező töltésveszteség szintén befolyásolhatja a méretet, és hozzájárulhat a megfigyelt méreteloszláshoz.
Ezenkívül a szerkezetenkénti töltés körülbelül 22-44 e-, a helyzettől függően, ami jelentősen magasabb az alap EWNS-hez képest, amelynek átlagos töltése szerkezetenként 10 ± 2 elektron. Meg kell azonban jegyezni, hogy ez az EWNS átlagos töltése. Seto és munkatársai kimutatták, hogy a töltés inhomogén és log-normális eloszlást követ21. Korábbi munkánkhoz képest a felületi töltés megduplázása az EPES rendszerben a lerakódási hatékonyságot majdnem 100%-ra növeli11.