Хвала вам што сте посетили Nature.com. Верзија прегледача коју користите има ограничену подршку за CSS. За најбоље искуство, препоручујемо вам да користите ажурирани прегледач (или да онемогућите режим компатибилности у Internet Explorer-у). У међувремену, како бисмо осигурали континуирану подршку, приказиваћемо сајт без стилова и JavaScript-а.
Недавно је развијена антимикробна платформа без хемикалија заснована на нанотехнологији коришћењем вештачких наноструктура воде (EWNS). EWNS имају високо површинско наелектрисање и засићене су реактивним врстама кисеоника (ROS) које могу да интерагују са бројним микроорганизмима и да их инактивирају, укључујући патогене који се преносе храном. Овде је показано да се њихова својства током синтезе могу фино подесити и оптимизовати како би се додатно побољшао њихов антибактеријски потенцијал. Лабораторијска платформа EWNS је дизајнирана да фино подеси својства EWNS променом параметара синтезе. Карактеризација својстава EWNS (наелектрисање, величина и садржај ROS) коришћењем савремених аналитичких метода. Поред тога, процењен је њихов потенцијал микробне инактивације против микроорганизама који се преносе храном, као што су Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum и Saccharomyces cerevisiae. Резултати представљени овде показују да се својства EWNS могу фино подесити током синтезе, што резултира експоненцијалним повећањем ефикасности инактивације. Конкретно, површинско наелектрисање се повећало за фактор четири, а реактивне врсте кисеоника су се повећале. Брзина уклањања микроба била је зависна од микроба и кретала се од 1,0 до 3,8 log након 45 минута излагања аеросолној дози од 40.000 #/cc EWNS.
Микробна контаминација је главни узрок болести изазваних храном услед уноса патогена или њихових токсина. Само у Сједињеним Државама, болести изазване храном узрокују око 76 милиона болести, 325.000 хоспитализација и 5.000 смртних случајева сваке године1. Поред тога, Министарство пољопривреде Сједињених Држава (USDA) процењује да је повећана конзумација свежих производа одговорна за 48% свих пријављених болести изазваних храном у Сједињеним Државама2. Трошкови болести и смрти изазваних патогенима који се преносе храном у Сједињеним Државама су веома високи, а Центри за контролу и превенцију болести (CDC) процењују их на више од 15,6 милијарди америчких долара годишње3.
Тренутно се хемијске4, радијационе5 и термичке6 антимикробне интервенције ради обезбеђивања безбедности хране углавном спроводе на ограниченим критичним контролним тачкама (ККТ) дуж производног ланца (обично након жетве и/или током паковања), а не континуирано. Стога су склоне унакрсној контаминацији. 7. Боља контрола болести које се преносе храном и кварења хране захтева антимикробне интервенције које се потенцијално могу применити у целом континууму од фарме до трпезе, уз смањење утицаја на животну средину и трошкова.
Недавно је развијена антимикробна платформа без хемикалија, заснована на нанотехнологији, која може да инактивира површинске и ваздушне бактерије користећи вештачке наноструктуре воде (EWNS). EWNS је синтетисан коришћењем два паралелна процеса, електроспреја и јонизације воде (Сл. 1а). Претходне студије су показале да EWNS имају јединствен скуп физичких и биолошких својстава8,9,10. EWNS имају просечно 10 електрона по структури и просечну наноскалну величину од 25 nm (Сл. 1б,ц)8,9,10. Поред тога, електронска спинска резонанца (ESR) је показала да EWNS садржи велику количину реактивних врста кисеоника (ROS), углавном хидроксил (OH•) и супероксидних (O2-) радикала (Сл. 1ц)8. EVNS је у ваздуху дуго времена и може се сударити са микроорганизмима суспендованим у ваздуху и присутним на површини, испоручујући свој ROS терет и изазивајући инактивацију микроорганизама (Сл. 1д). Ове ране студије су такође показале да EWNS могу да интерагују са различитим грам-негативним и грам-позитивним бактеријама, укључујући микобактерије, на површинама и у ваздуху и да их инактивирају. Трансмисиона електронска микроскопија је показала да је инактивација узрокована поремећајем ћелијске мембране. Поред тога, студије акутне инхалације су показале да високе дозе EWNS не изазивају оштећење плућа или упалу 8.
(а) Електрораспршивање настаје када се високи напон примени између капиларне цеви која садржи течност и контраелектроде. (б) Примена високог притиска резултира два различита феномена: (и) електрораспршивањем воде и (ии) формирањем реактивних врста кисеоника (јона) заробљених у EWNS. (ц) Јединствена структура EWNS. (д) Због своје наноразмерне природе, EWNS су веома мобилни и могу да интерагују са патогенима који се преносе ваздухом.
Недавно је демонстрирана и способност антимикробне платформе EWNS да инактивира микроорганизме који се преносе храном на површини свеже хране. Такође је показано да се површинско наелектрисање EWNS-а у комбинацији са електричним пољем може користити за постизање циљане испоруке. Штавише, прелиминарни резултати за органски парадајз након 90-минутног излагања EWNS-у од око 50.000 #/cm3 били су охрабрујући, при чему су примећени различити микроорганизми који се преносе храном, као што су E. coli и Listeria 11. Поред тога, прелиминарни органолептички тестови нису показали сензорне ефекте у поређењу са контролним парадајзом. Иако су ови почетни резултати инактивације охрабрујући за примене у безбедности хране чак и при веома ниским дозама EWNS-а од 50.000#/cm³, јасно је да би већи потенцијал инактивације био кориснији за даље смањење ризика од инфекције и кварења.
Овде ћемо фокусирати наша истраживања на развој платформе за генерисање EWNS-а како бисмо омогућили фино подешавање параметара синтезе и оптимизацију физичко-хемијских својстава EWNS-а ради побољшања њиховог антибактеријског потенцијала. Посебно, оптимизација је усмерена на повећање њиховог површинског наелектрисања (ради побољшања циљане испоруке) и садржаја ROS-а (ради побољшања ефикасности инактивације). Карактерисати оптимизована физичко-хемијска својства (величина, наелектрисање и садржај ROS) користећи модерне аналитичке методе и користити уобичајене микроорганизме у храни као што је E.
EVNS је синтетисан истовременим електрораспршивањем и јонизацијом воде високе чистоће (18 MΩ cm–1). Електрични небулизатор 12 се обично користи за атомизацију течности и синтезу полимерних и керамичких честица 13 и влакана 14 контролисане величине.
Као што је детаљно описано у претходним публикацијама 8, 9, 10, 11, у типичном експерименту, висок напон је примењен између металне капиларе и уземљене контраелектроде. Током овог процеса, дешавају се два различита феномена: i) електроспреј и ii) јонизација воде. Јако електрично поље између две електроде узрокује накупљање негативних наелектрисања на површини кондензоване воде, што резултира формирањем Тејлорових конуса. Као резултат тога, формирају се високо наелектрисане капљице воде, које се настављају разбијати на мање честице, као у Рејлијевој теорији16. Истовремено, јака електрична поља узрокују да се неки молекули воде цепају и откидају електроне (јонизују), што доводи до формирања велике количине реактивних врста кисеоника (ROS)17. Истовремено генерисана ROS18 је капсулирана у EWNS (Сл. 1ц).
На слици 2а приказан је систем за генерисање EWNS-а развијен и коришћен у EWNS синтези у овој студији. Пречишћена вода ускладиштена у затвореној боци је доводина кроз тефлонску цев (унутрашњи пречник 2 mm) у иглу од нерђајућег челика 30G (метална капилар). Проток воде се контролише притиском ваздуха унутар боце, као што је приказано на слици 2б. Игла је монтирана на тефлонску конзолу и може се ручно подесити на одређену удаљеност од контраелектроде. Контраелектрода је полирани алуминијумски диск са рупом у центру за узорковање. Испод контраелектроде налази се алуминијумски левак за узорковање, који је повезан са остатком експерименталне поставке преко отвора за узорковање (слика 2б). Да би се избегло накупљање наелектрисања које би могло да поремети рад узорковача, све компоненте узорковача су електрично уземљене.
(а) Систем за генерисање пројектованих наноструктура воде (EWNS). (б) Попречни пресек узорковача и електроспреја, са најважнијим параметрима. (ц) Експериментална поставка за инактивацију бактерија.
Систем за генерисање EWNS-а описан горе може да мења кључне оперативне параметре како би се олакшало фино подешавање својстава EWNS-а. Подесите примењени напон (V), растојање између игле и контраелектроде (L) и проток воде (φ) кроз капилар да бисте фино подесили карактеристике EWNS-а. Симбол који се користи за представљање различитих комбинација: [V (kV), L (cm)]. Подесите проток воде да бисте добили стабилан Тејлоров конус одређеног скупа [V, L]. За потребе ове студије, пречник отвора контраелектроде (D) је одржаван на 0,5 инча (1,29 cm).
Због ограничене геометрије и асиметрије, јачина електричног поља не може се израчунати из првих принципа. Уместо тога, за израчунавање електричног поља коришћен је софтвер QuickField™ (Свендборг, Данска)19. Електрично поље није једнообразно, па је вредност електричног поља на врху капиларе коришћена као референтна вредност за различите конфигурације.
Током студије, неколико комбинација напона и растојања између игле и контраелектроде је процењено у смислу формирања Тејлоровог конуса, стабилности Тејлоровог конуса, стабилности производње EWNS-а и репродуктивности. Различите комбинације су приказане у Додатној табели S1.
Излаз система за генерисање EWNS-а био је директно повезан са анализатором величине честица скенирајуће мобилности (SMPS, модел 3936, TSI, Шорвју, Минесота) за мерење концентрације броја честица, као и са аеросолним Фарадејевим електрометром (TSI, модел 3068B, Шорвју, Минесота). ) за мерење аеросолних струја као што је описано у нашој претходној публикацији. И SMPS и аеросолни електрометар узорковали су брзином протока од 0,5 L/min (укупни проток узорка 1 L/min). Концентрација броја честица и проток аеросола мерени су 120 секунди. Мерење се понавља 30 пута. На основу мерења струје, израчунава се укупно аеросолосно наелектрисање и процењује се просечно EWNS наелектрисање за дати укупан број одабраних EWNS честица. Просечна цена EWNS-а може се израчунати помоћу једначине (1):
где је IEl измерена струја, NSMPS је дигитална концентрација измерена помоћу SMPS-а, а φEl је брзина протока по електрометру.
Пошто релативна влажност (RH) утиче на површинско наелектрисање, температура и (RH) су одржаване константним током експеримента на 21°C и 45%, респективно.
За мерење величине и животног века EWNS коришћени су атомска силова микроскопија (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Санта Барбара, Калифорнија) и AC260T сонда (Olympus, Токио, Јапан). Фреквенција скенирања AFM-ом била је 1 Hz, површина скенирања 5 μm × 5 μm и 256 линија скенирања. Све слике су подвргнуте поравнању слика првог реда коришћењем Asylum софтвера (опсег маске 100 nm, праг 100 pm).
Тест левак је уклоњен, а површина лискуна је постављена на растојању од 2,0 цм од контраелектроде током просечног времена од 120 с како би се избегла агломерација честица и формирање неправилних капљица на површини лискуна. EWNS је директно прскан на површину свеже исеченог лискуна (Тед Пела, Рединг, Калифорнија). Слика површине лискуна одмах након AFM распршивања. Контактни угао површине свеже исеченог немодификованог лискуна је близу 0°, тако да је EVNS распоређен на површини лискуна у облику куполе. Пречник (a) и висина (h) дифузујућих капљица су мерени директно из AFM топографије и коришћени за израчунавање EWNS куполасте дифузионе запремине користећи нашу претходно валидирану методу. Под претпоставком да уграђени EWNS имају исту запремину, еквивалентни пречник се може израчунати помоћу једначине (2):
На основу наше претходно развијене методе, коришћена је спинска замка електронске спинске резонанце (ESR) за детекцију присуства краткотрајних радикалских интермедијера у EWNS. Аеросоли су пропуштани кроз Midget распршивач од 650 μm (Ace Glass, Vineland, NJ) који садржи 235 mM раствор DEPMPO(5-(диетоксифосфорил)-5-метил-1-пиролин-N-оксида) (Oxis International Inc.). Портланд, Орегон. Сва ESR мерења су извршена коришћењем Bruker EMX спектрометра (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, САД) и ћелије са равним панелом. За прикупљање и анализу података коришћен је софтвер Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, САД). Одређивање карактеристика ROS је спроведено само за скуп радних услова [-6,5 kV, 4,0 cm]. Концентрације EWNS су мерене коришћењем SMPS-а након урачунавања губитака EWNS у ударнику.
Нивои озона су праћени помоћу 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Боулдер, Колорадо)8,9,10.
За сва својства EWNS-а, средња вредност се користи као вредност мерења, а стандардна девијација се користи као грешка мерења. Т-тестови су извршени да би се упоредиле вредности оптимизованих атрибута EWNS-а са одговарајућим вредностима основног EWNS-а.
Слика 2ц приказује претходно развијен и окарактерисан систем „повлачења“ електростатичког таложења (EPES) који се може користити за циљану испоруку EWNS на површину. EPES користи EVNS наелектрисања која се могу „водити“ директно на површину мете под утицајем јаког електричног поља. Детаљи EPES система представљени су у недавној публикацији Пиргиотакиса и др. 11. Дакле, EPES се састоји од 3D штампане PVC коморе са суженим крајевима и садржи две паралелне металне плоче од нерђајућег челика (нерђајући челик 304, са огледалским премазом) у центру, удаљене 15,24 цм. Плоче су биле повезане са спољним извором високог напона (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), доња плоча је увек била повезана са позитивним напоном, а горња плоча је увек била повезана са земљом (плутајуће уземљење). Зидови коморе су прекривени алуминијумском фолијом, која је електрично уземљена како би се спречио губитак честица. Комора има запечаћена предња врата за пуњење која омогућавају постављање тестних површина на пластичне постоља која их подижу изнад доње металне плоче како би се избегле сметње високог напона.
Ефикасност таложења EWNS у EPES је израчуната према претходно развијеном протоколу детаљно описаном у Додатној слици S111.
Као контролна комора, друга цилиндрична проточна комора је била серијски повезана са EPES системом, у коме је коришћен међу-HEPA филтер за уклањање EWNS-а. Као што је приказано на слици 2ц, EWNS аеросол је пумпан кроз две уграђене коморе. Филтер између контролне собе и EPES-а уклања све преостале EWNS-е, што резултира истом температуром (T), релативном влажношћу (RH) и нивоима озона.
Утврђено је да важни микроорганизми који се преносе храном контаминирају свежу храну, као што су E. coli (ATCC #27325), фекални индикатор, Salmonella enterica (ATCC #53647), патоген који се преноси храном, Listeria nonseaful (ATCC #33090), сурогат за патогену Listeria monocytogenes, изведена из ATCC (Манасас, Вирџинија) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), замена за квасац који изазива кварење, и отпорнија инактивирана бактерија, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Купите насумичне кутије органског парадајза са локалне пијаце и чувајте их у фрижидеру на 4°C до употребе (до 3 дана). Експериментални парадајзи су били сви исте величине, пречника око 1,5 цм.
Протоколи за културу, инокулацију, излагање и бројање колонија детаљно су описани у нашој претходној публикацији и у Додатним подацима. Ефикасност EWNS-а је процењена излагањем инокулираних парадајза концентрацији од 40.000 #/cm3 током 45 минута. Укратко, три парадајза су коришћена за процену преживелих микроорганизама у времену t = 0 мин. Три парадајза су стављена у EPES и изложена EWNS-у концентрацији од 40.000 #/cc (парадајз изложен EWNS-у), а преостала три су стављена у контролну комору (контролни парадајз). Додатна обрада парадајза у обе групе није спроведена. Парадајз изложени EWNS-у и контролни парадајз су уклоњени након 45 минута да би се проценио ефекат EWNS-а.
Сваки експеримент је спроведен у три примерка. Анализа података је извршена према протоколу описаном у Додатним подацима.
Механизми инактивације су процењени седиментацијом изложених узорака EWNS (45 мин при концентрацији аеросола EWNS од 40.000 #/cm3) и неозрачених узорака безопасних бактерија E. coli, Salmonella enterica и Lactobacillus. Честице су фиксиране у 2,5% глутаралдехиду, 1,25% параформалдехиду и 0,03% пикринској киселини у 0,1 M натријум какодилат пуферу (pH 7,4) током 2 сата на собној температури. Након прања, постфиксирати са 1% осмијум тетроксида (OsO4)/1,5% калијум фероцијанида (KFeCN6) током 2 сата, испрати 3 пута у води и инкубирати у 1% уранил ацетату током 1 сата, затим испрати два пута у води, а затим дехидрирати 10 минута у 50%, 70%, 90%, 100% алкохолу. Узорци су затим стављени у пропилен оксид на 1 сат и импрегнирани смешом пропилен оксида и TAAP Epon-а у односу 1:1 (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Узорци су уграђени у TAAB Epon и полимеризовани на 60°C током 48 сати. Очвршћена гранулирана смола је исечена и визуализована TEM-ом коришћењем конвенционалног трансмисионог електронског микроскопа JEOL 1200EX (JEOL, Токио, Јапан) опремљеног AMT 2k CCD камером (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, САД).
Сви експерименти су спроведени у три примерка. За сваку временску тачку, бактеријски испирани узорци су посејани у три примерка, што је резултирало укупно девет тачака података по тачки, чији је просек коришћен као концентрација бактерија за тај одређени микроорганизам. Стандардна девијација је коришћена као грешка мерења. Све тачке се рачунају.
Логаритам смањења концентрације бактерија у поређењу са t = 0 min израчунат је коришћењем следеће формуле:
где је C0 концентрација бактерија у контролном узорку у тренутку 0 (тј. након што се површина осушила, али пре него што је стављена у комору) и Cn је концентрација бактерија на површини након n минута излагања.
Да би се објаснила природна разградња бактерија током излагања од 45 минута, логаритамско смањење у поређењу са контролом након 45 минута је такође израчунато на следећи начин:
где је Cn концентрација бактерија у контролном узорку у времену n, а Cn-Control је концентрација контролних бактерија у времену n. Подаци су приказани као логаритамско смањење у поређењу са контролом (без излагања EWNS-у).
Током студије, неколико комбинација напона и растојања између игле и контраелектроде процењено је у смислу формирања Тејлоровог конуса, стабилности Тејлоровог конуса, стабилности производње EWNS и репродуктивности. Различите комбинације су приказане у Додатној табели С1. Два случаја која показују стабилна и репродуктивна својства (Тејлоров конус, генерисање EWNS и стабилност током времена) одабрана су за свеобухватну студију. На слици 3 приказани су резултати за наелектрисање, величину и садржај ROS у оба случаја. Резултати су такође сумирани у Табели 1. Ради референце, и слика 3 и Табела 1 укључују својства претходно синтетизованих неоптимизованих EWNS8, 9, 10, 11 (основни-EWNS). Прорачуни статистичке значајности коришћењем двостраног t-теста поново су објављени у Додатној табели С2. Поред тога, додатни подаци укључују студије утицаја пречника отвора за узорковање контраелектроде (D) и растојања између уземљене електроде и врха (L) (Додатне слике С2 и С3).
(ac) Расподела величине мерена AFM-ом. (df) Карактеристика површинског наелектрисања. (g) ROS карактеризација EPR-а.
Такође је важно напоменути да је за све горе наведене услове измерена струја јонизације била између 2 и 6 μA, а напон између -3,8 и -6,5 kV, што је резултирало потрошњом енергије мањом од 50 mW за овај контактни модул за генерисање једног EWNS-а. Иако је EWNS синтетисан под високим притиском, нивои озона су били веома ниски, никада нису прелазили 60 ppb.
Додатна слика S4 приказује симулирана електрична поља за сценарије [-6,5 kV, 4,0 cm] и [-3,8 kV, 0,5 cm], респективно. За сценарије [-6,5 kV, 4,0 cm] и [-3,8 kV, 0,5 cm], прорачуни поља су 2 × 10⁶ V/m и 4,7 × 10⁶ V/m, респективно. Ово је очекивано, јер је у другом случају однос напона и растојања много већи.
На слици 3а,б приказан је пречник EWNS измерен помоћу AFM8. Израчунати просечни пречници EWNS били су 27 nm и 19 nm за шеме [-6,5 kV, 4,0 cm] и [-3,8 kV, 0,5 cm], респективно. За сценарије [-6,5 kV, 4,0 cm] и [-3,8 kV, 0,5 cm], геометријске стандардне девијације дистрибуција су 1,41 и 1,45, респективно, што указује на уску дистрибуцију величине. И средња величина и геометријска стандардна девијација су веома близу основној EWNS, на 25 nm и 1,41, респективно. На слици 3ц приказана је дистрибуција величине основног EWNS мерена коришћењем исте методе под истим условима.
На слици 3д,е приказани су резултати карактеризације наелектрисања. Подаци представљају просечна мерења 30 истовремених мерења концентрације (#/цм3) и струје (I). Анализа показује да је просечно наелектрисање на EWNS-у 22 ± 6 е- и 44 ± 6 е- за [-6,5 kV, 4,0 цм] и [-3,8 kV, 0,5 цм], респективно. Имају значајно већа површинска наелектрисања у поређењу са основним EWNS-ом (10 ± 2 е-), два пута већа од сценарија [-6,5 kV, 4,0 цм] и четири пута већа од сценарија [-3,8 kV, 0,5 цм]. Слика 3ф приказује податке о наелектрисању за основни EWNS.
Из мапа концентрације EWNS броја (додатне слике S5 и S6), може се видети да сценарио [-6,5 kV, 4,0 cm] има знатно више честица него сценарио [-3,8 kV, 0,5 cm]. Такође је вредно напоменути да је концентрација EWNS броја праћена до 4 сата (додатне слике S5 и S6), где је стабилност генерисања EWNS показала исте нивое концентрације броја честица у оба случаја.
На слици 3г приказан је ЕПР спектар након одузимања оптимизоване контроле EWNS (позадина) на [-6,5 kV, 4,0 cm]. ROS спектри су такође упоређени са сценаријем Baseline-EWNS у претходно објављеном раду. Број EWNS који реагују са спинским замкама израчунат је на 7,5 × 10⁴ EWNS/s, што је слично претходно објављеном Baseline-EWNS8. EPR спектри су јасно показали присуство две врсте ROS, при чему је O2- доминантна врста, а OH• мање заступљен. Поред тога, директно поређење интензитета пикова показало је да оптимизовани EWNS има значајно већи садржај ROS у поређењу са основним EWNS.
На слици 4 приказана је ефикасност таложења EWNS у EPES. Подаци су такође сумирани у Табели I и упоређени са оригиналним EWNS подацима. За оба случаја EUNS-а, таложење је близу 100% чак и при ниском напону од 3,0 kV. Типично, 3,0 kV је довољно за 100% таложења, без обзира на промену површинског наелектрисања. Под истим условима, ефикасност таложења Baseline-EWNS-а била је само 56% због њиховог нижег наелектрисања (просечно 10 електрона по EWNS-у).
На слици 5 и у табели 2 сумирана је вредност инактивације микроорганизама инокулираних на површини парадајза након излагања око 40.000 #/cm3 EWNS током 45 минута на оптималном режиму [-6,5 kV, 4,0 cm]. Инокулирани E. coli и Lactobacillus innocuous показали су значајно смањење од 3,8 log током излагања од 45 минута. Под истим условима, S. enterica је имала смањење од 2,2 log, док су S. cerevisiae и M. parafortutum имали смањење од 1,0 log.
Електронски микрографије (слика 6) приказују физичке промене изазване EWNS-ом на безопасним ћелијама Escherichia coli, Streptococcus и Lactobacillus, што је довело до њихове инактивације. Контролне бактерије су имале нетакнуте ћелијске мембране, док су изложене бактерије имале оштећене спољашње мембране.
Електронско микроскопско снимање контролних и изложених бактерија открило је оштећење мембране.
Подаци о физичко-хемијским својствима оптимизованих EWNS-а заједно показују да су својства (површинско наелектрисање и садржај ROS-а) EWNS-а значајно побољшана у поређењу са претходно објављеним основним подацима EWNS-а8,9,10,11. С друге стране, њихова величина је остала у нанометарском опсегу, што је веома слично резултатима који су раније објављени, што им омогућава да остану у ваздуху током дужег временског периода. Уочена полидисперзност може се објаснити променама површинског наелектрисања које одређују величину EWNS-а, случајношћу Рејлијевог ефекта и потенцијалном коалесценцијом. Међутим, како су детаљно описали Нилсен и др.22, високо површинско наелектрисање смањује испаравање ефикасним повећањем површинске енергије/напона капи воде. У нашој претходној публикацији8 ова теорија је експериментално потврђена за микрокапљице22 и EWNS. Губитак наелектрисања током времена такође може утицати на величину и допринети уоченој расподели величине.
Поред тога, наелектрисање по структури је око 22-44 е-, у зависности од ситуације, што је знатно више у поређењу са основним EWNS-ом, који има просечно наелектрисање од 10 ± 2 електрона по структури. Међутим, треба напоменути да је ово просечно наелектрисање EWNS-а. Сето и др. Показано је да је наелектрисање нехомогено и да прати лог-нормалну расподелу21. У поређењу са нашим претходним радом, удвостручавање површинског наелектрисања удвостручује ефикасност таложења у EPES систему на скоро 100%11.