Gràcies per visitar Nature.com. La versió del navegador que esteu utilitzant té compatibilitat limitada amb CSS. Per a una millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). Mentrestant, per garantir el suport continu, renderem el lloc web sense estils ni JavaScript.
Recentment, s'ha desenvolupat una plataforma antimicrobiana lliure de productes químics basada en la nanotecnologia que utilitza nanoestructures d'aigua artificial (EWNS). Les EWNS tenen una càrrega superficial elevada i estan saturades amb espècies reactives d'oxigen (ROS) que poden interactuar amb diversos microorganismes i inactivar-los, inclosos els patògens transmesos pels aliments. Aquí es demostra que les seves propietats durant la síntesi es poden ajustar i optimitzar per millorar encara més el seu potencial antibacterià. La plataforma de laboratori EWNS va ser dissenyada per ajustar les propietats de les EWNS canviant els paràmetres de síntesi. Caracterització de les propietats de les EWNS (càrrega, mida i contingut de ROS) mitjançant mètodes analítics moderns. A més, es va avaluar el seu potencial d'inactivació microbiana contra microorganismes transmesos pels aliments com ara Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum i Saccharomyces cerevisiae. Els resultats presentats aquí demostren que les propietats de les EWNS es poden ajustar durant la síntesi, la qual cosa resulta en un augment exponencial de l'eficiència d'inactivació. En particular, la càrrega superficial va augmentar per un factor de quatre i les espècies reactives d'oxigen van augmentar. La taxa d'eliminació microbiana depenia dels microbis i oscil·lava entre 1,0 i 3,8 log després d'una exposició de 45 minuts a una dosi d'aerosol de 40.000 #/cc d'EWNS.
La contaminació microbiana és la principal causa de les malalties transmeses pels aliments causades per la ingestió de patògens o les seves toxines. Només als Estats Units, les malalties transmeses pels aliments causen uns 76 milions de malalties, 325.000 ingressos hospitalaris i 5.000 morts cada any1. A més, el Departament d'Agricultura dels Estats Units (USDA) estima que l'augment del consum de productes frescos és responsable del 48% de totes les malalties transmeses pels aliments notificades als Estats Units2. El cost de les malalties i les morts causades per patògens transmesos pels aliments als Estats Units és molt elevat, estimat pels Centres per al Control i la Prevenció de Malalties (CDC) en més de 15.600 milions de dòlars anuals3.
Actualment, les intervencions antimicrobianes químiques4, radioactives5 i tèrmiques6 per garantir la seguretat alimentària es duen a terme principalment en punts crítics de control (PCC) limitats al llarg de la cadena de producció (normalment després de la collita i/o durant l'envasament) en lloc de de manera contínua. Per tant, són propenses a la contaminació creuada. 7. Un millor control de les malalties transmeses pels aliments i el deteriorament dels aliments requereix intervencions antimicrobianes que es puguin aplicar potencialment al llarg del continu de la granja a la taula, alhora que redueixen l'impacte i els costos ambientals.
Recentment, s'ha desenvolupat una plataforma antimicrobiana basada en la nanotecnologia i lliure de productes químics que pot inactivar bacteris superficials i aerotransportats mitjançant nanoestructures d'aigua artificial (EWNS). Les EWNS es van sintetitzar mitjançant dos processos paral·lels, electroaspersió i ionització d'aigua (Fig. 1a). Estudis previs han demostrat que les EWNS tenen un conjunt únic de propietats físiques i biològiques8,9,10. Les EWNS tenen una mitjana de 10 electrons per estructura i una mida nanomètrica mitjana de 25 nm (Fig. 1b,c)8,9,10. A més, la ressonància d'espín electrònic (ESR) va mostrar que les EWNS contenen una gran quantitat d'espècies reactives d'oxigen (ROS), principalment radicals hidroxil (OH•) i superòxid (O2-) (Fig. 1c)8. Les EVNS estan a l'aire durant molt de temps i poden xocar amb microorganismes suspesos a l'aire i presents a la superfície, lliurant la seva càrrega útil de ROS i provocant la inactivació dels microorganismes (Fig. 1d). Aquests primers estudis també van mostrar que les EWNS poden interactuar amb diversos bacteris gramnegatius i grampositius, incloent-hi les micobacteris, i inactivar-los en superfícies i a l'aire. La microscòpia electrònica de transmissió va mostrar que la inactivació era causada per la disrupció de la membrana cel·lular. A més, els estudis d'inhalació aguda han demostrat que les dosis altes d'EWNS no causen danys pulmonars ni inflamació 8.
(a) L'electropolvorització es produeix quan s'aplica un alt voltatge entre un tub capil·lar que conté líquid i un contraelèctrode. (b) L'aplicació d'alta pressió provoca dos fenòmens diferents: (i) electropolvorització d'aigua i (ii) formació d'espècies reactives d'oxigen (ions) atrapades a les EWNS. (c) L'estructura única de les EWNS. (d) A causa de la seva naturalesa a nanoescala, les EWNS són altament mòbils i poden interactuar amb patògens transportats per l'aire.
Recentment també s'ha demostrat la capacitat de la plataforma antimicrobiana EWNS per inactivar microorganismes transmesos pels aliments a la superfície d'aliments frescos. També s'ha demostrat que la càrrega superficial de l'EWNS en combinació amb un camp elèctric es pot utilitzar per aconseguir un lliurament dirigit. A més, els resultats preliminars per a tomàquets orgànics després d'una exposició de 90 minuts a un EWNS d'uns 50.000 #/cm3 van ser encoratjadors, i s'hi van observar diversos microorganismes transmesos pels aliments com ara E. coli i Listeria 11. A més, les proves organolèptiques preliminars no van mostrar efectes sensorials en comparació amb els tomàquets de control. Tot i que aquests resultats inicials d'inactivació són encoratjadors per a aplicacions de seguretat alimentària, fins i tot amb dosis molt baixes d'EWNS de 50.000 #/cc. vegeu, és clar que un potencial d'inactivació més alt seria més beneficiós per reduir encara més el risc d'infecció i deteriorament.
Aquí, centrarem la nostra recerca en el desenvolupament d'una plataforma de generació d'EWNS per permetre l'afinament dels paràmetres de síntesi i l'optimització de les propietats fisicoquímiques dels EWNS per millorar el seu potencial antibacterià. En particular, l'optimització s'ha centrat en augmentar la seva càrrega superficial (per millorar l'administració dirigida) i el contingut de ROS (per millorar l'eficiència d'inactivació). Caracteritzar les propietats fisicoquímiques optimitzades (mida, càrrega i contingut de ROS) mitjançant mètodes analítics moderns i utilitzar microorganismes alimentaris comuns com ara E. .
L'EVNS es va sintetitzar mitjançant electropolvorització i ionització simultànies d'aigua d'alta puresa (18 MΩ cm–1). El nebulitzador elèctric 12 s'utilitza normalment per a l'atomització de líquids i la síntesi de partícules de polímer i ceràmica 13 i fibres 14 de mida controlada.
Com es detalla en publicacions anteriors 8, 9, 10, 11, en un experiment típic, es va aplicar un alt voltatge entre un capil·lar metàl·lic i un contraelèctrode connectat a terra. Durant aquest procés, es produeixen dos fenòmens diferents: i) electroaspersió i ii) ionització de l'aigua. Un fort camp elèctric entre els dos elèctrodes fa que s'acumulin càrregues negatives a la superfície de l'aigua condensada, donant lloc a la formació de cons de Taylor. Com a resultat, es formen gotes d'aigua altament carregades, que continuen trencant-se en partícules més petites, com en la teoria de Rayleigh16. Al mateix temps, els forts camps elèctrics fan que algunes molècules d'aigua es divideixin i s'arrosseguin d'electrons (ionitzin), cosa que condueix a la formació d'una gran quantitat d'espècies reactives d'oxigen (ROS)17. El ROS18 generat simultàniament es va encapsular en EWNS (Fig. 1c).
La figura 2a mostra el sistema de generació d'EWNS desenvolupat i utilitzat en la síntesi d'EWNS en aquest estudi. L'aigua purificada emmagatzemada en una ampolla tancada es va alimentar a través d'un tub de tefló (2 mm de diàmetre interior) a una agulla d'acer inoxidable de 30G (capil·lar metàl·lic). El flux d'aigua es controla mitjançant la pressió d'aire dins de l'ampolla, tal com es mostra a la figura 2b. L'agulla està muntada en una consola de tefló i es pot ajustar manualment a una certa distància del contraelèctrode. El contraelèctrode és un disc d'alumini polit amb un forat al centre per al mostreig. Sota el contraelèctrode hi ha un embut de mostreig d'alumini, que està connectat a la resta de la configuració experimental a través d'un port de mostreig (figura 2b). Per evitar l'acumulació de càrrega que podria interrompre el funcionament del mostrejador, tots els components del mostrejador estan connectats a terra elèctricament.
(a) Sistema de generació de nanoestructures d'aigua dissenyat (EWNS). (b) Secció transversal del mostrejador i l'electroaspersió, que mostra els paràmetres més importants. (c) Configuració experimental per a la inactivació de bacteris.
El sistema de generació d'EWNS descrit anteriorment és capaç de canviar els paràmetres operatius clau per facilitar l'ajust fi de les propietats de l'EWNS. Ajusteu el voltatge aplicat (V), la distància entre l'agulla i el contraelèctrode (L) i el flux d'aigua (φ) a través del capil·lar per ajustar les característiques de l'EWNS. Símbol utilitzat per representar diferents combinacions: [V (kV), L (cm)]. Ajusteu el flux d'aigua per obtenir un con de Taylor estable d'un cert conjunt [V, L]. Per als propòsits d'aquest estudi, el diàmetre d'obertura del contraelèctrode (D) es va mantenir a 0,5 polzades (1,29 cm).
A causa de la geometria limitada i l'asimetria, la intensitat del camp elèctric no es pot calcular a partir de principis bàsics. En comptes d'això, es va utilitzar el programari QuickField™ (Svendborg, Dinamarca)19 per calcular el camp elèctric. El camp elèctric no és uniforme, per la qual cosa el valor del camp elèctric a la punta del capil·lar es va utilitzar com a valor de referència per a diverses configuracions.
Durant l'estudi, es van avaluar diverses combinacions de voltatge i distància entre l'agulla i el contraelèctrode pel que fa a la formació del con de Taylor, l'estabilitat del con de Taylor, l'estabilitat de la producció d'EWNS i la reproductibilitat. Diverses combinacions es mostren a la Taula Suplementària S1.
La sortida del sistema de generació d'EWNS es va connectar directament a un analitzador de mida de partícules de mobilitat d'escaneig (SMPS, model 3936, TSI, Shoreview, MN) per a la mesura de la concentració numèrica de partícules, així com a un electròmetre de Faraday d'aerosols (TSI, model 3068B, Shoreview, MN). ) per als corrents d'aerosols es va mesurar tal com es descriu a la nostra publicació anterior. Tant l'SMPS com l'electròmetre d'aerosols van prendre mostres a un cabal de 0,5 L/min (cabal total de mostra 1 L/min). La concentració numèrica de partícules i el flux d'aerosols es van mesurar durant 120 segons. El mesurament es repeteix 30 vegades. A partir dels mesuraments de corrent, es calcula la càrrega total d'aerosols i s'estima la càrrega mitjana d'EWNS per a un nombre total determinat de partícules d'EWNS seleccionades. El cost mitjà d'EWNS es pot calcular mitjançant l'equació (1):
on IEl és el corrent mesurat, NSMPS és la concentració digital mesurada amb l'SMPS i φEl és el cabal per electròmetre.
Com que la humitat relativa (HR) afecta la càrrega superficial, la temperatura i la (HR) es van mantenir constants durant l'experiment a 21 °C i 45%, respectivament.
Es va utilitzar microscòpia de força atòmica (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) i la sonda AC260T (Olympus, Tòquio, Japó) per mesurar la mida i la vida útil de l'EWNS. La freqüència d'escaneig AFM era d'1 Hz, l'àrea d'escaneig era de 5 μm × 5 μm i 256 línies d'escaneig. Totes les imatges es van sotmetre a una alineació d'imatges de primer ordre mitjançant el programari Asylum (rang de màscara 100 nm, llindar 100 pm).
Es va retirar l'embut de prova i es va col·locar la superfície de la mica a una distància de 2,0 cm del contraelèctrode durant un temps de mitjana de 120 s per evitar l'aglomeració de partícules i la formació de gotes irregulars a la superfície de la mica. L'EWNS es va ruixar directament sobre la superfície de la mica recentment tallada (Ted Pella, Redding, CA). Imatge de la superfície de la mica immediatament després de la polvorització AFM. L'angle de contacte de la superfície de la mica sense modificar recentment tallada és proper a 0°, de manera que l'EVNS es distribueix a la superfície de la mica en forma de cúpula. El diàmetre (a) i l'alçada (h) de les gotes difusores es van mesurar directament a partir de la topografia AFM i es van utilitzar per calcular el volum de difusió en cúpula de l'EWNS mitjançant el nostre mètode validat prèviament. Suposant que els EWNS integrats tenen el mateix volum, el diàmetre equivalent es pot calcular mitjançant l'equació (2):
Basant-nos en el nostre mètode desenvolupat prèviament, es va utilitzar una trampa d'espín de ressonància d'espín electrònic (ESR) per detectar la presència d'intermediaris radicals de vida curta en EWNS. Els aerosols es van bombollejar a través d'un burbujeador Midget de 650 μm (Ace Glass, Vineland, NJ) que contenia una solució de 235 mM de DEPMPO(5-(dietoxifosforil)-5-metil-1-pirrolina-N-òxid) (Oxis International Inc.). Portland, Oregon). Totes les mesures d'ESR es van realitzar mitjançant un espectròmetre Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, EUA) i una cel·la de panell pla. Es va utilitzar el programari Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, EUA) per recopilar i analitzar les dades. La determinació de les característiques dels ROS es va dur a terme només per a un conjunt de condicions d'operació [-6,5 kV, 4,0 cm]. Les concentracions d'EWNS es van mesurar mitjançant l'SMPS després de tenir en compte les pèrdues d'EWNS a l'impactador.
Els nivells d'ozó es van monitoritzar mitjançant un monitor d'ozó de doble feix 205™ (2B Technologies, Boulder, Colorado)8,9,10.
Per a totes les propietats EWNS, el valor mitjà s'utilitza com a valor de mesura i la desviació estàndard s'utilitza com a error de mesura. Es van realitzar proves t per comparar els valors dels atributs EWNS optimitzats amb els valors corresponents de l'EWNS base.
La figura 2c mostra un sistema de "tirada" de precipitació electrostàtica (EPES) desenvolupat i caracteritzat prèviament que es pot utilitzar per a l'administració dirigida d'EWNS a la superfície. L'EPES utilitza càrregues EVNS que es poden "guiar" directament a la superfície de l'objectiu sota la influència d'un fort camp elèctric. Els detalls del sistema EPES es presenten en una publicació recent de Pyrgiotakis et al. 11. Així, l'EPES consisteix en una cambra de PVC impresa en 3D amb extrems cònics i conté dues plaques metàl·liques paral·leles d'acer inoxidable (acer inoxidable 304, recobertes de mirall) al centre, separades per 15,24 cm. Les plaques es van connectar a una font externa d'alt voltatge (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), la placa inferior sempre es va connectar a un voltatge positiu i la placa superior sempre es va connectar a terra (terra flotant). Les parets de la cambra estan cobertes amb paper d'alumini, que està connectat a terra elèctricament per evitar la pèrdua de partícules. La cambra té una porta de càrrega frontal segellada que permet col·locar les superfícies de prova sobre suports de plàstic que les eleven per sobre de la placa metàl·lica inferior per evitar interferències d'alt voltatge.
L'eficiència de deposició d'EWNS en EPES es va calcular segons un protocol desenvolupat prèviament detallat a la figura suplementària S111.
Com a cambra de control, es va connectar una segona cambra de flux cilíndrica en sèrie al sistema EPES, en el qual es va utilitzar un filtre HEPA intermedi per eliminar les EWNS. Com es mostra a la Figura 2c, l'aerosol d'EWNS es va bombar a través de dues cambres integrades. El filtre entre la sala de control i l'EPES elimina les EWNS restants, donant lloc a la mateixa temperatura (T), humitat relativa (HR) i nivells d'ozó.
S'ha descobert que importants microorganismes transmesos pels aliments contaminen aliments frescos com ara E. coli (ATCC #27325), indicador fecal, Salmonella enterica (ATCC #53647), patogen transmès pels aliments, Listeria harmful (ATCC #33090), substitut de la Listeria monocytogenes patògena, derivada de Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) d'ATCC (Manassas, VA), un substitut del llevat de deteriorament, i un bacteri inactivat més resistent, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Compra caixes aleatòries de tomàquets de raïm orgànics al teu mercat local i refrigereu-los a 4 °C fins al moment d'utilitzar-los (fins a 3 dies). Els tomàquets experimentals tenien tots la mateixa mida, aproximadament 1,25 cm de diàmetre.
Els protocols de cultiu, inoculació, exposició i recompte de colònies es detallen a la nostra publicació anterior i es detallen a les dades suplementàries. L'eficàcia de l'EWNS es va avaluar exposant tomàquets inoculats a 40.000 #/cm3 durant 45 minuts. Breument, es van utilitzar tres tomàquets per avaluar els microorganismes supervivents en el temps t = 0 min. Es van col·locar tres tomàquets en EPES i es van exposar a EWNS a 40.000 #/cc (tomàquets exposats a EWNS) i els tres restants es van col·locar a la cambra de control (tomàquets de control). No es va dur a terme un processament addicional dels tomàquets en cap grup. Els tomàquets exposats a EWNS i els tomàquets de control es van retirar després de 45 minuts per avaluar l'efecte de l'EWNS.
Cada experiment es va dur a terme per triplicat. L'anàlisi de dades es va realitzar segons el protocol descrit a les dades suplementàries.
Els mecanismes d'inactivació es van avaluar mitjançant la sedimentació de mostres d'EWNS exposades (45 min a una concentració d'aerosol d'EWNS de 40.000 #/cm3) i mostres no irradiades de bacteris inofensius E. coli, Salmonella enterica i Lactobacillus. Les partícules es van fixar en glutaraldehid al 2,5%, paraformaldehid a l'1,25% i àcid pícric al 0,03% en tampó de cacodilat de sodi 0,1 M (pH 7,4) durant 2 hores a temperatura ambient. Després del rentat, es va fixar posteriorment amb tetròxid d'osmi (OsO4) a l'1,5% i ferrocianur de potassi (KFeCN6) a l'1,5% durant 2 hores, es va rentar 3 vegades amb aigua i es va incubar en acetat d'uranil a l'1% durant 1 hora, després es va rentar dues vegades amb aigua i després es va deshidratar durant 10 minuts en alcohol al 50%, 70%, 90% i 100%. A continuació, les mostres es van col·locar en òxid de propilè durant 1 hora i es van impregnar amb una barreja 1:1 d'òxid de propilè i TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Les mostres es van incrustar en TAAB Epon i es van polimeritzar a 60 °C durant 48 hores. La resina granular curada es va tallar i visualitzar mitjançant TEM utilitzant un microscopi electrònic de transmissió convencional JEOL 1200EX (JEOL, Tòquio, Japó) equipat amb una càmera CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, EUA).
Tots els experiments es van dur a terme per triplicat. Per a cada punt de temps, es van sembrar rentats bacterians per triplicat, donant com a resultat un total de nou punts de dades per punt, la mitjana dels quals es va utilitzar com a concentració bacteriana per a aquell microorganisme en particular. La desviació estàndard es va utilitzar com a error de mesura. Tots els punts compten.
El logaritme de la disminució de la concentració de bacteris en comparació amb t = 0 min es va calcular mitjançant la fórmula següent:
on C0 és la concentració de bacteris a la mostra de control en el temps 0 (és a dir, després que la superfície s'hagi assecat però abans de col·locar-la a la cambra) i Cn és la concentració de bacteris a la superfície després de n minuts d'exposició.
Per tenir en compte la degradació natural dels bacteris durant l'exposició de 45 minuts, la reducció logarítmica en comparació amb el control després de 45 minuts també es va calcular de la següent manera:
on Cn és la concentració de bacteris a la mostra de control en el temps n i Cn-Control és la concentració de bacteris de control en el temps n. Les dades es presenten com una reducció logarítmica en comparació amb el control (sense exposició a EWNS).
Durant l'estudi, es van avaluar diverses combinacions de voltatge i distància entre l'agulla i el contraelèctrode en termes de formació de con de Taylor, estabilitat del con de Taylor, estabilitat de la producció d'EWNS i reproductibilitat. A la taula suplementària S1 es mostren diverses combinacions. Es van seleccionar dos casos que mostren propietats estables i reproduïbles (con de Taylor, generació d'EWNS i estabilitat al llarg del temps) per a un estudi exhaustiu. A la figura 3, es mostren els resultats de la càrrega, la mida i el contingut de ROS en ambdós casos. Els resultats també es resumeixen a la taula 1. Com a referència, tant la figura 3 com la taula 1 inclouen les propietats dels EWNS8, 9, 10, 11 (EWNS de referència) no optimitzats sintetitzats prèviament. Els càlculs de significació estadística mitjançant una prova t bilateral es tornen a publicar a la taula suplementària S2. A més, les dades addicionals inclouen estudis de l'efecte del diàmetre del forat de mostreig del contraelèctrode (D) i la distància entre l'elèctrode de terra i la punta (L) (figures suplementàries S2 i S3).
(ac) Distribució de mida mesurada per AFM. (df) Característica de càrrega superficial. (g) Caracterització ROS de l'EPR.
També és important tenir en compte que, per a totes les condicions anteriors, el corrent d'ionització mesurat va ser d'entre 2 i 6 μA i el voltatge d'entre -3,8 i -6,5 kV, cosa que va resultar en un consum d'energia inferior a 50 mW per a aquest mòdul de contacte de generació únic d'EWNS. Tot i que l'EWNS es va sintetitzar a alta pressió, els nivells d'ozó van ser molt baixos, sense superar mai els 60 ppb.
La figura suplementària S4 mostra els camps elèctrics simulats per als escenaris [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivament. Per als escenaris [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm], els càlculs de camp són 2 × 105 V/m i 4,7 × 105 V/m, respectivament. Això és d'esperar, ja que en el segon cas la relació voltatge-distància és molt més alta.
A la figura 3a i b es mostra el diàmetre de l'EWNS mesurat amb l'AFM8. Els diàmetres mitjans calculats de l'EWNS van ser de 27 nm i 19 nm per als esquemes [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivament. Per als escenaris [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm], les desviacions estàndard geomètriques de les distribucions són d'1,41 i 1,45, respectivament, cosa que indica una distribució de mida estreta. Tant la mida mitjana com la desviació estàndard geomètrica són molt properes a l'EWNS de referència, a 25 nm i 1,41, respectivament. A la figura 3c es mostra la distribució de mida de l'EWNS de referència mesurat utilitzant el mateix mètode en les mateixes condicions.
A la figura 3d, la figura e mostra els resultats de la caracterització de la càrrega. Les dades són mesures mitjanes de 30 mesures simultànies de concentració (#/cm3) i corrent (I). L'anàlisi mostra que la càrrega mitjana a l'EWNS és de 22 ± 6 e- i 44 ± 6 e- per a [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivament. Tenen càrregues superficials significativament més altes en comparació amb l'EWNS de referència (10 ± 2 e-), dues vegades més grans que l'escenari [-6,5 kV, 4,0 cm] i quatre vegades més grans que l'escenari [-3,8 kV, 0,5 cm]. La figura 3f mostra les dades de càrrega per a l'EWNS de referència.
A partir dels mapes de concentració del nombre d'EWNS (figures suplementàries S5 i S6), es pot veure que l'escenari [-6,5 kV, 4,0 cm] té significativament més partícules que l'escenari [-3,8 kV, 0,5 cm]. També val la pena assenyalar que la concentració del nombre d'EWNS es va controlar fins a 4 hores (figures suplementàries S5 i S6), on l'estabilitat de la generació d'EWNS va mostrar els mateixos nivells de concentració del nombre de partícules en ambdós casos.
La figura 3g mostra l'espectre EPR després de la subtracció del control EWNS optimitzat (fons) a [-6,5 kV, 4,0 cm]. Els espectres ROS també es van comparar amb l'escenari Baseline-EWNS en un treball publicat anteriorment. El nombre d'EWNS que reaccionaven amb trampes d'espín es va calcular en 7,5 × 104 EWNS/s, cosa similar al Baseline-EWNS8 publicat anteriorment. Els espectres EPR van mostrar clarament la presència de dos tipus de ROS, amb O2- com a espècie predominant i OH• com a menys abundant. A més, una comparació directa de les intensitats màximes va mostrar que els EWNS optimitzats tenien un contingut de ROS significativament més alt en comparació amb els EWNS de referència.
La figura 4 mostra l'eficiència de deposició d'EWNS en EPES. Les dades també es resumeixen a la Taula I i es comparen amb les dades originals d'EWNS. Per a ambdós casos d'EUNS, la deposició és propera al 100% fins i tot a un voltatge baix de 3.0 kV. Normalment, 3.0 kV és suficient per a una deposició del 100%, independentment del canvi de càrrega superficial. En les mateixes condicions, l'eficiència de deposició de Baseline-EWNS va ser només del 56% a causa de la seva menor càrrega (una mitjana de 10 electrons per EWNS).
A la figura 5 i a la taula 2 es resumeix el valor d'inactivació dels microorganismes inoculats a la superfície dels tomàquets després de l'exposició a uns 40.000 #/cm3 d'EWNS durant 45 minuts en el mode òptim [-6,5 kV, 4,0 cm]. E. coli i Lactobacillus innocuous inoculats van mostrar una reducció significativa de 3,8 log durant els 45 minuts d'exposició. En les mateixes condicions, S. enterica va tenir una disminució de 2,2 log, mentre que S. cerevisiae i M. parafortutum van tenir una disminució d'1,0 log.
Les micrografies electròniques (Figura 6) mostren els canvis físics induïts per EWNS en cèl·lules inofensives d'Escherichia coli, Streptococcus i Lactobacillus, cosa que provoca la seva inactivació. Els bacteris de control tenien membranes cel·lulars intactes, mentre que els bacteris exposats tenien membranes externes danyades.
Les imatges de microscòpia electrònica dels bacteris de control i exposats van revelar danys a la membrana.
Les dades sobre les propietats fisicoquímiques dels EWNS optimitzats mostren col·lectivament que les propietats (càrrega superficial i contingut de ROS) dels EWNS van millorar significativament en comparació amb les dades de referència dels EWNS publicades anteriorment8,9,10,11. D'altra banda, la seva mida es va mantenir en el rang nanomètric, molt similar als resultats publicats anteriorment, cosa que els va permetre romandre a l'aire durant llargs períodes de temps. La polidispersió observada es pot explicar pels canvis de càrrega superficial que determinen la mida dels EWNS, l'aleatorietat de l'efecte Rayleigh i la potencial coalescència. Tanmateix, tal com detallen Nielsen et al. 22, una càrrega superficial elevada redueix l'evaporació augmentant eficaçment l'energia/tensió superficial de la gota d'aigua. En la nostra publicació anterior8, aquesta teoria es va confirmar experimentalment per a microgotes 22 i EWNS. La pèrdua de càrrega durant el temps extra també pot afectar la mida i contribuir a la distribució de mida observada.
A més, la càrrega per estructura és d'uns 22-44 e-, depenent de la situació, cosa que és significativament més alta en comparació amb l'EWNS bàsic, que té una càrrega mitjana de 10 ± 2 electrons per estructura. Tanmateix, cal tenir en compte que aquesta és la càrrega mitjana de l'EWNS. Seto et al. S'ha demostrat que la càrrega és heterogènia i segueix una distribució log-normal21. En comparació amb el nostre treball anterior, duplicar la càrrega superficial duplica l'eficiència de deposició en el sistema EPES a gairebé el 100%11.