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최근 인공 물 나노구조(EWNS)를 이용한 나노기술 기반의 무화학 항균 플랫폼이 개발되었습니다. EWNS는 높은 표면 전하를 가지고 있으며, 식품 매개 병원균을 포함한 여러 미생물과 상호작용하고 불활성화할 수 있는 활성 산소(ROS)로 포화되어 있습니다. 본 연구에서는 합성 과정에서 EWNS의 특성을 미세 조정하고 최적화하여 항균 잠재력을 더욱 향상시킬 수 있음을 보여줍니다. EWNS 실험실 플랫폼은 합성 매개변수를 변경하여 EWNS의 특성을 미세 조정하도록 설계되었습니다. 최신 분석 방법을 사용하여 EWNS 특성(ROS의 전하, 크기 및 함량)을 특성화합니다. 또한 대장균, 살모넬라 엔테리카, 리스테리아 이노쿠어스, 마이코박테리움 파라아시덴툼, 사카로마이세스 세레비시아와 같은 식품 매개 미생물에 대한 미생물 불활성화 잠재력을 평가했습니다. 본 연구에 제시된 결과는 EWNS의 특성이 합성 과정에서 미세 조정될 수 있으며, 이를 통해 불활성화 효율이 기하급수적으로 증가함을 보여줍니다. 특히, 표면 전하가 4배 증가했고 활성 산소종도 증가했습니다. 미생물 제거율은 미생물에 따라 달랐으며, 40,000 #/cc의 EWNS 에어로졸 농도에 45분간 노출시킨 후 1.0~3.8 log의 범위였습니다.
미생물 오염은 병원균이나 그 독소의 섭취로 인한 식중독의 주요 원인입니다. 미국에서만 매년 약 7,600만 건의 식중독이 발생하고, 32만 5천 건의 입원과 5천 건의 사망이 발생합니다.1 또한, 미국 농무부(USDA)는 신선 농산물 소비 증가가 미국에서 보고된 모든 식중독의 48%를 차지한다고 추산합니다.2 미국에서 식중독균으로 인한 질병 및 사망 비용은 매우 높으며, 질병통제예방센터(CDC)는 이를 연간 156억 달러 이상으로 추산합니다.3
현재 식품 안전을 보장하기 위한 화학적4, 방사선5, 열6 항균 처리는 생산 과정의 제한된 중요 관리 지점(CCP)(보통 수확 후 및/또는 포장 과정)에서만 수행되며, 지속적으로 이루어지지는 않습니다. 따라서 교차 오염이 발생하기 쉽습니다. 7. 식품 매개 질병과 식품 부패를 효과적으로 관리하려면 환경 영향과 비용을 줄이는 동시에 농장에서 식탁까지의 전 과정에 걸쳐 적용될 수 있는 항균 처리가 필요합니다.
최근, 인공 물 나노구조(EWNS)를 이용하여 표면 및 공기 중 박테리아를 불활성화할 수 있는 화학물질을 사용하지 않는 나노기술 기반 항균 플랫폼이 개발되었습니다. EWNS는 전기분무와 물 이온화라는 두 가지 병렬 공정을 사용하여 합성되었습니다(그림 1a). 이전 연구에서 EWNS는 고유한 물리적 및 생물학적 특성을 가지고 있음이 밝혀졌습니다.8,9,10 EWNS는 구조당 평균 10개의 전자를 가지고 있으며 평균 나노스케일 크기는 25nm입니다(그림 1b,c)8,9,10. 또한 전자 스핀 공명(ESR)은 EWNS가 다량의 활성 산소종(ROS), 주로 하이드록실(OH•) 및 슈퍼옥사이드(O2-) 라디칼을 함유하고 있음을 보여주었습니다(그림 1c)8. EVNS는 오랫동안 공기 중에 존재하며 공기 중에 부유하고 표면에 존재하는 미생물과 충돌하여 ROS 페이로드를 전달하고 미생물을 불활성화시킬 수 있습니다(그림 1d). 이러한 초기 연구들은 EWNS가 표면 및 공기 중 결핵균을 포함한 다양한 그람 음성균 및 그람 양성균과 상호작용하여 불활성화시킬 수 있음을 보여주었습니다. 투과전자현미경 검사 결과, 이러한 불활성화는 세포막 파괴로 인해 발생하는 것으로 나타났습니다. 또한, 급성 흡입 연구에서는 고용량의 EWNS가 폐 손상이나 염증을 유발하지 않는 것으로 나타났습니다.8
(a) 전기분사는 액체가 담긴 모세관과 상대 전극 사이에 고전압을 인가할 때 발생합니다. (b) 고압을 인가하면 두 가지 다른 현상이 발생합니다. (i) 물의 전기분사 및 (ii) EWNS에 갇힌 활성 산소종(이온)의 형성. (c) EWNS의 고유한 구조. (d) 나노스케일 특성으로 인해 EWNS는 매우 이동성이 뛰어나 공기 중 병원균과 상호 작용할 수 있습니다.
EWNS 항균 플랫폼이 신선식품 표면의 식품매개 미생물을 불활성화하는 능력 또한 최근 입증되었습니다. 또한, EWNS의 표면 전하와 전기장을 함께 사용하여 표적 전달을 달성할 수 있음이 밝혀졌습니다. 또한, 유기농 토마토를 약 50,000 #/cm³의 EWNS에 90분간 노출시킨 예비 결과는 대장균과 리스테리아균 11과 같은 다양한 식품매개 미생물이 관찰되어 고무적이었습니다. 또한, 예비 관능 검사에서 대조군 토마토와 비교하여 감각적 효과는 나타나지 않았습니다. 이러한 초기 불활성화 결과는 50,000 #/cc의 매우 낮은 EWNS 용량에서도 식품 안전 적용에 고무적이지만, 더 높은 불활성화 잠재력이 감염 및 부패 위험을 더욱 줄이는 데 더 유익할 것이라는 것은 분명합니다.
본 연구에서는 합성 매개변수의 미세 조정과 EWNS의 물리화학적 특성 최적화를 통해 항균 잠재력을 향상시키는 EWNS 생성 플랫폼 개발에 집중할 것입니다. 특히, 최적화는 표면 전하 증가(표적 전달 향상)와 ROS 함량 증가(불활성화 효율 향상)에 중점을 두었습니다. 최신 분석 방법을 활용하여 최적화된 물리화학적 특성(크기, 전하 및 ROS 함량)을 분석하고, E. . 와 같은 일반적인 식품 미생물을 활용합니다.
EVNS는 고순도 물(18 MΩ·cm–1)의 전기분무와 이온화를 동시에 수행하여 합성되었습니다. 전기 분무기 12는 일반적으로 액체의 분무와 조절된 크기의 폴리머 및 세라믹 입자 13, 그리고 섬유 14의 합성에 사용됩니다.
이전 출판물 8, 9, 10, 11에서 자세히 설명했듯이, 일반적인 실험에서 금속 모세관과 접지된 상대 전극 사이에 고전압이 인가되었습니다. 이 과정에서 두 가지 다른 현상이 발생합니다. i) 전기 분무 및 ii) 물 이온화. 두 전극 사이의 강한 전기장은 응축된 물 표면에 음전하를 축적하여 테일러 콘을 형성합니다. 결과적으로 고하전된 물방울이 형성되고, 이 물방울은 레일리 이론16에서처럼 더 작은 입자로 계속 분해됩니다. 동시에 강한 전기장은 일부 물 분자를 분열시켜 전자를 떼어내(이온화) 많은 양의 활성 산소종(ROS)17을 형성합니다. 동시에 생성된 ROS18는 EWNS에 캡슐화되었습니다(그림 1c).
그림 2a는 본 연구에서 EWNS 합성에 개발 및 사용된 EWNS 생성 시스템을 보여줍니다. 밀폐된 병에 저장된 정제수는 테플론 튜브(내경 2mm)를 통해 30G 스테인리스 스틸 바늘(금속 모세관)로 공급되었습니다. 물의 흐름은 그림 2b와 같이 병 내부의 공기압에 의해 제어됩니다. 바늘은 테플론 콘솔에 장착되어 있으며 상대 전극으로부터 일정 거리까지 수동으로 조정할 수 있습니다. 상대 전극은 중앙에 샘플링을 위한 구멍이 있는 광택 처리된 알루미늄 디스크입니다. 상대 전극 아래에는 알루미늄 샘플링 깔때기가 있으며, 샘플링 포트를 통해 나머지 실험 장치에 연결됩니다(그림 2b). 샘플러 작동을 방해할 수 있는 전하 축적을 방지하기 위해 모든 샘플러 구성 요소는 전기적으로 접지됩니다.
(a) 엔지니어링된 물 나노구조 생성 시스템(EWNS). (b) 가장 중요한 매개변수를 보여주는 샘플러와 전기분무의 단면도. (c) 박테리아 불활성화를 위한 실험 설정.
위에서 설명한 EWNS 생성 시스템은 주요 작동 매개변수를 변경하여 EWNS 특성의 미세 조정을 용이하게 할 수 있습니다. 인가 전압(V), 바늘과 상대 전극 사이의 거리(L), 그리고 모세관을 통과하는 물의 흐름(φ)을 조절하여 EWNS 특성을 미세 조정할 수 있습니다. 다양한 조합을 나타내는 기호는 [V(kV), L(cm)]입니다. 특정 [V, L]의 안정적인 테일러 콘을 얻기 위해 물의 흐름을 조절합니다. 본 연구에서는 상대 전극의 개구 직경(D)을 0.5인치(1.29cm)로 유지했습니다.
제한된 기하 구조와 비대칭성으로 인해 전기장 세기를 기본 원리로 계산할 수 없습니다. 대신, QuickField™ 소프트웨어(스벤보르, 덴마크)19를 사용하여 전기장을 계산했습니다. 전기장은 균일하지 않으므로, 모세관 끝부분의 전기장 값을 다양한 구성의 기준값으로 사용했습니다.
연구 기간 동안 바늘과 상대전극 사이의 전압과 거리의 여러 조합을 테일러 콘 형성, 테일러 콘 안정성, EWNS 생성 안정성, 그리고 재현성 측면에서 평가했습니다. 다양한 조합은 보충 표 S1에 제시되어 있습니다.
EWNS 생성 시스템의 출력은 입자 수 농도 측정을 위해 스캐닝 이동성 입자 크기 분석기(SMPS, 모델 3936, TSI, Shoreview, MN)와 에어로졸 패러데이 전위계(TSI, 모델 3068B, Shoreview, MN)에 직접 연결되었습니다. 에어로졸 전류는 이전 논문에서 설명한 대로 측정되었습니다. SMPS와 에어로졸 전위계는 모두 0.5L/min(총 샘플 유량 1L/min)의 유량으로 샘플링되었습니다. 입자 수 농도와 에어로졸 유량은 120초 동안 측정되었습니다. 측정은 30회 반복되었습니다. 전류 측정값을 기반으로 총 에어로졸 전하를 계산하고, 선택된 EWNS 입자의 주어진 총 수에 대한 평균 EWNS 전하를 추정합니다. EWNS의 평균 비용은 식 (1)을 사용하여 계산할 수 있습니다.
여기서 IEl은 측정된 전류이고, NSMPS는 SMPS로 측정한 디지털 농도이며, φEl은 전기계당 유량입니다.
상대 습도(RH)는 표면 전하에 영향을 미치므로 실험 동안 온도와 (RH)는 각각 21°C와 45%로 일정하게 유지되었습니다.
원자간력현미경(AFM), Asylum MFP-3D(Asylum Research, 캘리포니아주 산타바바라) 및 AC260T 프로브(Olympus, 일본 도쿄)를 사용하여 EWNS의 크기와 수명을 측정했습니다. AFM 스캐닝 주파수는 1Hz, 스캐닝 영역은 5μm x 5μm, 그리고 스캔 라인은 256개였습니다. 모든 이미지는 Asylum 소프트웨어(마스크 범위 100nm, 임계값 100pm)를 사용하여 1차 이미지 정렬을 수행했습니다.
시험 깔때기를 제거하고 운모 표면을 상대 전극으로부터 2.0cm 떨어진 곳에 평균 120초 동안 두어 입자 응집 및 운모 표면에 불규칙한 액적 형성을 방지했습니다. EWNS를 새로 절단한 운모(Ted Pella, Redding, CA) 표면에 직접 분무했습니다. AFM 스퍼터링 직후 운모 표면의 이미지입니다. 새로 절단한 비변형 운모 표면의 접촉각은 0°에 가까워 EVNS가 운모 표면에 돔 형태로 분포합니다. 확산 액적의 직경(a)과 높이(h)는 AFM 지형에서 직접 측정하여 이전에 검증된 방법을 사용하여 EWNS 돔 확산 부피를 계산했습니다. 탑재된 EWNS의 부피가 동일하다고 가정할 때, 등가 직경은 식 (2)를 사용하여 계산할 수 있습니다.
이전에 개발한 방법을 기반으로, 전자 스핀 공명(ESR) 스핀 트랩을 사용하여 EWNS에서 수명이 짧은 라디칼 중간체의 존재를 검출했습니다. 에어로졸은 DEPMPO(5-(diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide)(Oxis International Inc., Portland, Oregon) 235 mM 용액이 담긴 650 μm Midget 스파저(Ace Glass, Vineland, NJ)를 통해 버블링되었습니다. 모든 ESR 측정은 Bruker EMX 분광기(Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA)와 평판 셀을 사용하여 수행되었습니다. Acquisit 소프트웨어(Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA)를 사용하여 데이터를 수집하고 분석했습니다. ROS의 특성 결정은 일련의 작동 조건[-6.5 kV, 4.0 cm]에 대해서만 수행되었습니다. EWNS 농도는 충격기에서의 EWNS 손실을 고려한 후 SMPS를 사용하여 측정되었습니다.
오존 수치는 205 Dual Beam Ozone Monitor™(2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10을 사용하여 모니터링되었습니다.
모든 EWNS 속성에 대해 평균값을 측정값으로, 표준편차를 측정 오차로 사용합니다. 최적화된 EWNS 속성값과 기준 EWNS 속성값을 비교하기 위해 t-검정을 수행했습니다.
그림 2c는 표면에 EWNS를 표적 전달하는 데 사용할 수 있는 이전에 개발되고 특성화된 전기 집진(EPES) "풀" 시스템을 보여줍니다. EPES는 강한 전기장의 영향으로 표적 표면으로 직접 "유도"될 수 있는 EVNS 전하를 사용합니다. EPES 시스템의 세부 사항은 Pyrgiotakis 등의 최근 출판물에 나와 있습니다. 11 따라서 EPES는 테이퍼형 끝이 ​​있는 3D 인쇄 PVC 챔버로 구성되며 중앙에 15.24cm 간격으로 두 개의 평행한 스테인리스 스틸(304 스테인리스 스틸, 미러 코팅) 금속판이 있습니다. 보드는 외부 고전압 소스(Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY)에 연결되었고, 바닥판은 항상 양전압에 연결되었으며, 상단판은 항상 접지(부동 접지)에 연결되었습니다. 챔버 벽은 입자 손실을 방지하기 위해 전기적으로 접지된 알루미늄 호일로 덮여 있습니다. 챔버에는 밀폐된 전면 로딩 도어가 있어 테스트 표면을 플라스틱 스탠드에 올려놓을 수 있으며, 이 스탠드는 고전압 간섭을 피하기 위해 바닥 금속판 위로 테스트 표면을 올립니다.
EPES에서 EWNS의 증착 효율은 보충 그림 S111에 자세히 설명된 기존에 개발된 프로토콜에 따라 계산되었습니다.
제어실로서 두 번째 원통형 유동 챔버를 EPES 시스템에 직렬로 연결했으며, 이 챔버에서 중간 HEPA 필터를 사용하여 EWNS를 제거했습니다. 그림 2c에서 볼 수 있듯이, EWNS 에어로졸은 두 개의 내장 챔버를 통해 펌핑되었습니다. 제어실과 EPES 사이의 필터는 잔류 EWNS를 제거하여 동일한 온도(T), 상대 습도(RH), 오존 농도를 유지합니다.
대장균(ATCC #27325), 대변 지표균, 살모넬라 엔테리카(ATCC #53647), 식품 병원균, 리스테리아 무해균(ATCC #33090), ATCC(버지니아주 매너서스)에서 유래한 병원성 리스테리아 모노사이토제네스의 대체균, 부패 효모 대체균인 사카로미세스 세레비시아(ATCC #4098) 및 내성이 더 강한 불활성 세균인 마이코박테리움 파라럭키(ATCC #19686)와 같은 중요한 식품 매개 미생물이 신선 식품을 오염시키는 것으로 밝혀졌습니다.
지역 마트에서 유기농 방울토마토를 무작위로 여러 상자 사서 사용하기 전까지 4°C에서 냉장 보관하세요(최대 3일). 실험에 사용한 토마토는 모두 크기가 같았고, 지름이 약 1.2cm였습니다.
배양, 접종, 노출 및 군집 계수 프로토콜은 이전 논문과 보충 자료에 자세히 설명되어 있습니다. EWNS의 효과는 접종된 토마토를 40,000 #/cm³의 농도에 45분 동안 노출시켜 평가했습니다. 간략하게 설명하면, 토마토 세 개를 사용하여 t = 0분 시점에 생존하는 미생물을 평가했습니다. 토마토 세 개를 EPES에 넣고 40,000 #/cc의 농도로 EWNS에 노출시켰고(EWNS 노출 토마토), 나머지 세 개는 대조군(대조군 토마토)에 두었습니다. 두 군 모두 토마토에 대한 추가 처리는 수행하지 않았습니다. EWNS 노출 토마토와 대조군 토마토는 45분 후 꺼내 EWNS의 효과를 평가했습니다.
각 실험은 3회 반복하여 수행되었습니다. 데이터 분석은 보충 자료에 기술된 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
불활성화 기전은 노출된 EWNS 샘플(40,000 #/cm3 EWNS 에어로졸 농도에서 45분)과 방사선 조사되지 않은 무해한 박테리아 E. coli, Salmonella enterica 및 Lactobacillus 샘플을 침전시켜 평가했습니다. 입자는 0.1 M sodium cacodylate 완충액(pH 7.4)에 2.5% 글루타르알데히드, 1.25% 파라포름알데히드, 0.03% 피크르산을 첨가하여 실온에서 2시간 동안 고정했습니다. 세척 후, 1% 오스뮴 테트록사이드(OsO4)/1.5% 칼륨 페로시안화물(KFeCN6) 용액으로 2시간 동안 후고정하고, 물로 3회 세척한 후 1% 우라닐 아세테이트 용액에서 1시간 동안 배양하고, 물로 2회 세척한 후 50%, 70%, 90%, 100% 알코올 용액에서 10분간 탈수했습니다. 샘플을 프로필렌 옥사이드에 1시간 동안 담근 후, 프로필렌 옥사이드와 TAAP Epon(Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA)의 1:1 혼합물에 함침시켰다. 샘플을 TAAB Epon에 포매하고 60°C에서 48시간 동안 중합시켰다. 경화된 과립형 수지를 절단하여 AMT 2k CCD 카메라(Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, USA)가 장착된 기존 투과전자현미경 JEOL 1200EX(JEOL, Tokyo, Japan)를 사용하여 TEM으로 시각화하였다.
모든 실험은 3회 반복하여 수행되었습니다. 각 시점마다 박테리아 세척액을 3회 반복하여 접종하여 각 시점당 총 9개의 데이터 포인트를 얻었으며, 이 평균값을 해당 미생물의 박테리아 농도로 사용했습니다. 표준 편차는 측정 오차로 사용되었습니다. 모든 포인트가 유효합니다.
t = 0분과 비교한 박테리아 농도 감소의 로그는 다음 공식을 사용하여 계산되었습니다.
여기서 C0는 시간 0(즉, 표면이 건조되었지만 챔버에 넣기 전)에서 대조 샘플의 박테리아 농도이고 Cn은 노출 후 n분 후 표면에 있는 박테리아 농도입니다.
45분 노출 동안 박테리아의 자연적 분해를 설명하기 위해 45분 후 대조군과 비교한 로그 감소도 다음과 같이 계산했습니다.
여기서 Cn은 시점 n에서 대조군 샘플의 박테리아 농도이고, Cn-Control은 시점 n에서 대조군 박테리아 농도입니다. 데이터는 대조군(EWNS 노출 없음) 대비 로그 감소로 표시됩니다.
연구 동안, 테일러 콘 형성, 테일러 콘 안정성, EWNS 생성 안정성 및 재현성 측면에서 바늘과 상대 전극 사이의 전압과 거리의 여러 조합이 평가되었습니다. 다양한 조합이 보충 표 S1에 나와 있습니다. 안정적이고 재현 가능한 특성을 보이는 두 가지 사례(테일러 콘, EWNS 생성 및 시간 경과에 따른 안정성)가 포괄적인 연구를 위해 선택되었습니다. 그림 3은 두 경우 모두에서 ROS의 전하, 크기 및 함량에 대한 결과를 보여줍니다. 결과는 표 1에도 요약되어 있습니다. 참고로, 그림 3과 표 1은 모두 이전에 합성된 최적화되지 않은 EWNS8, 9, 10, 11(기준선-EWNS)의 특성을 포함합니다. 양측 t-검정을 사용한 통계적 유의성 계산은 보충 표 S2에 다시 게시되었습니다. 또한, 추가 데이터에는 상대 전극 샘플링 구멍 직경(D)과 접지 전극과 팁 사이의 거리(L)의 영향에 대한 연구가 포함됩니다(보충 그림 S2 및 S3).
(ac) AFM으로 측정한 크기 분포. (df) 표면 전하 특성. (g) EPR의 ROS 특성.
위의 모든 조건에서 측정된 이온화 전류는 2~6 μA, 전압은 -3.8~-6.5 kV였으며, 이는 이 단일 EWNS 생성 접촉 모듈의 전력 소비량이 50 mW 미만임을 의미합니다. EWNS는 고압 하에서 합성되었지만, 오존 농도는 매우 낮아 60 ppb를 넘지 않았습니다.
보충 그림 S4는 각각 [-6.5 kV, 4.0 cm] 및 [-3.8 kV, 0.5 cm] 시나리오에 대한 시뮬레이션된 전기장을 보여줍니다. [-6.5 kV, 4.0 cm] 및 [-3.8 kV, 0.5 cm] 시나리오의 경우, 전기장 계산값은 각각 2 × 105 V/m 및 4.7 × 105 V/m입니다. 이는 두 번째 경우의 전압-거리 비율이 훨씬 높기 때문에 예상된 결과입니다.
그림 3a, b는 AFM8로 측정한 EWNS 직경을 보여줍니다. 계산된 평균 EWNS 직경은 [-6.5 kV, 4.0 cm]와 [-3.8 kV, 0.5 cm] 방식에 대해 각각 27 nm와 19 nm였습니다. [-6.5 kV, 4.0 cm]와 [-3.8 kV, 0.5 cm] 시나리오의 경우 분포의 기하 표준 편차는 각각 1.41과 1.45로 좁은 크기 분포를 나타냅니다. 평균 크기와 기하 표준 편차는 모두 기준 EWNS에 매우 가까워 각각 25 nm와 1.41입니다. 그림 3c는 동일한 조건에서 동일한 방법을 사용하여 측정한 기본 EWNS의 크기 분포를 보여줍니다.
그림 3d,e는 ​​전하 특성 분석 결과를 보여줍니다.데이터는 농도(#/cm3)와 전류(I)를 동시에 30회 측정한 결과의 평균값입니다.분석 결과 EWNS의 평균 전하는 [-6.5 kV, 4.0 cm] 및 [-3.8 kV, 0.5 cm]에서 각각 22 ± 6 e- 및 44 ± 6 e-인 것으로 나타났습니다.이들은 기준 EWNS(10 ± 2 e-)에 비해 상당히 높은 표면 전하를 가지고 있으며, [-6.5 kV, 4.0 cm] 시나리오보다 2배, [-3.8 kV, 0.5 cm] 시나리오보다 4배 더 높습니다.그림 3f는 기준 EWNS의 전하 데이터를 보여줍니다.
EWNS 수 농도 분포도(보충 그림 S5 및 S6)를 보면 [-6.5 kV, 4.0 cm] 시나리오가 [-3.8 kV, 0.5 cm] 시나리오보다 훨씬 더 많은 입자를 포함하고 있음을 알 수 있습니다. 또한, EWNS 수 농도를 최대 4시간까지 모니터링한 결과(보충 그림 S5 및 S6) EWNS 생성 안정성은 두 경우 모두 동일한 수준의 입자 수 농도를 나타냈습니다.
그림 3g는 [-6.5 kV, 4.0 cm]에서 최적화된 EWNS 대조군(배경)을 뺀 후의 EPR 스펙트럼을 보여줍니다. ROS 스펙트럼은 이전에 발표된 연구에서 Baseline-EWNS 시나리오와도 비교되었습니다. 스핀 트랩과 반응하는 EWNS의 수는 7.5 × 104 EWNS/s로 계산되었으며, 이는 이전에 발표된 Baseline-EWNS8과 유사합니다. EPR 스펙트럼은 두 가지 유형의 ROS가 존재함을 명확히 보여주었는데, O2-가 우세하고 OH•가 덜 풍부했습니다. 또한, 피크 강도를 직접 비교한 ​​결과, 최적화된 EWNS의 ROS 함량이 Baseline EWNS보다 유의미하게 높았습니다.
그림 4는 EPES에서 EWNS의 증착 효율을 보여줍니다. 이 데이터는 표 I에 요약되어 있으며, 원본 EWNS 데이터와 비교되었습니다. 두 EUNS 모두 3.0 kV의 낮은 전압에서도 증착 효율이 100%에 가깝습니다. 일반적으로 표면 전하 변화에 관계없이 3.0 kV면 100% 증착에 충분합니다. 동일한 조건에서 Baseline-EWNS의 증착 효율은 낮은 전하(EWNS당 평균 전자 10개)로 인해 56%에 불과했습니다.
그림 5와 표 2는 토마토 표면에 접종된 미생물을 최적 모드 [-6.5 kV, 4.0 cm]에서 약 40,000 #/cm³의 EWNS에 45분간 노출시킨 후 불활성화 값을 요약한 것입니다. 접종된 대장균과 락토바실러스 이노쿠어스는 45분 노출 동안 3.8 log의 유의미한 감소를 보였습니다. 동일한 조건에서 S. enterica는 2.2 log 감소했고, S. cerevisiae와 M. parafortutum은 1.0 log 감소했습니다.
전자현미경 사진(그림 6)은 EWNS에 의해 무해한 대장균, 연쇄상구균, 그리고 락토바실러스 세포에 유도된 물리적 변화로 인해 세포가 불활성화되는 모습을 보여줍니다. 대조군 박테리아는 세포막이 온전한 반면, 노출된 박테리아는 세포막이 손상되었습니다.
대조군과 노출된 박테리아의 전자현미경 이미징 결과 세포막 손상이 드러났습니다.
최적화된 EWNS의 물리화학적 특성에 대한 데이터는 EWNS의 특성(표면 전하 및 ROS 함량)이 이전에 발표된 EWNS 기준 데이터8,9,10,11에 비해 상당히 개선되었음을 전체적으로 보여줍니다. 반면, 크기는 나노미터 범위로 유지되어 이전에 보고된 결과와 매우 유사하여 공기 중에 장시간 머물 수 있었습니다. 관찰된 다분산성은 EWNS의 크기, 레일리 효과의 무작위성, 그리고 잠재적인 합체를 결정하는 표면 전하 변화로 설명될 수 있습니다. 그러나 Nielsen et al.22에서 자세히 설명했듯이, 높은 표면 전하는 물방울의 표면 에너지/장력을 효과적으로 증가시켜 증발을 줄입니다. 이전 논문8에서 이 이론은 미세액적22과 EWNS에 대해 실험적으로 확인되었습니다. 시간 경과에 따른 전하 손실 또한 크기에 영향을 미치고 관찰된 크기 분포에 영향을 미칠 수 있습니다.
또한, 구조당 전하는 상황에 따라 약 22~44 e-로, 구조당 평균 전하량이 10 ± 2인 기본 EWNS에 비해 상당히 높습니다. 그러나 이는 EWNS의 평균 전하량이라는 점에 유의해야 합니다. Seto 등은 전하가 불균일하며 대수 정규 분포를 따르는 것으로 나타났습니다.21. 이전 연구와 비교했을 때, 표면 전하를 두 배로 늘리면 EPES 시스템의 증착 효율이 거의 100%11로 두 배 증가합니다.