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Recentemente, foi desenvolvida uma plataforma antimicrobiana livre de produtos químicos baseada em nanotecnologia usando nanoestruturas artificiais de água (EWNS). EWNS têm uma alta carga superficial e são saturadas com espécies reativas de oxigênio (ROS) que podem interagir e inativar uma série de microrganismos, incluindo patógenos de origem alimentar. Aqui é mostrado que suas propriedades durante a síntese podem ser ajustadas e otimizadas para aumentar ainda mais seu potencial antibacteriano. A plataforma de laboratório EWNS foi projetada para ajustar as propriedades de EWNS alterando os parâmetros de síntese. Caracterização das propriedades de EWNS (carga, tamanho e conteúdo de ROS) usando métodos analíticos modernos. Além disso, eles foram avaliados quanto ao seu potencial de inativação microbiana contra microrganismos de origem alimentar, como Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum e Saccharomyces cerevisiae. Os resultados apresentados aqui demonstram que as propriedades de EWNS podem ser ajustadas durante a síntese, resultando em um aumento exponencial na eficiência de inativação. Em particular, a carga superficial aumentou quatro vezes e as espécies reativas de oxigênio aumentaram. A taxa de remoção microbiana foi dependente da microbiota e variou de 1,0 a 3,8 log após uma exposição de 45 minutos a uma dose de aerossol de 40.000 #/cc de EWNS.
A contaminação microbiana é a principal causa de doenças transmitidas por alimentos, causadas pela ingestão de patógenos ou suas toxinas. Somente nos Estados Unidos, as doenças transmitidas por alimentos causam cerca de 76 milhões de doenças, 325.000 internações hospitalares e 5.000 mortes a cada ano¹. Além disso, o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) estima que o aumento do consumo de produtos frescos seja responsável por 48% de todas as doenças transmitidas por alimentos relatadas nos Estados Unidos². O custo de doenças e mortes causadas por patógenos transmitidos por alimentos nos Estados Unidos é muito alto, estimado pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) em mais de US$ 15,6 bilhões por ano³.
Atualmente, intervenções antimicrobianas químicas4, de radiação5 e térmicas6 para garantir a segurança alimentar são realizadas principalmente em pontos críticos de controle (PCCs) limitados ao longo da cadeia de produção (geralmente após a colheita e/ou durante a embalagem) em vez de continuamente. Assim, elas são propensas à contaminação cruzada. 7. Um melhor controle de doenças transmitidas por alimentos e deterioração de alimentos requer intervenções antimicrobianas que podem ser potencialmente aplicadas em todo o continuum da fazenda à mesa, ao mesmo tempo em que reduzem o impacto ambiental e os custos.
Recentemente, foi desenvolvida uma plataforma antimicrobiana livre de produtos químicos, baseada em nanotecnologia, que pode inativar bactérias de superfície e transportadas pelo ar usando nanoestruturas artificiais de água (EWNS). As EWNS foram sintetizadas usando dois processos paralelos, eletrospray e ionização de água (Fig. 1a). Estudos anteriores mostraram que as EWNS têm um conjunto único de propriedades físicas e biológicas8,9,10. As EWNS têm uma média de 10 elétrons por estrutura e um tamanho médio em nanoescala de 25 nm (Fig. 1b,c)8,9,10. Além disso, a ressonância de spin eletrônico (ESR) mostrou que as EWNS contêm uma grande quantidade de espécies reativas de oxigênio (ROS), principalmente radicais hidroxila (OH•) e superóxido (O2-) (Fig. 1c)8. As EVNS ficam no ar por um longo tempo e podem colidir com microrganismos suspensos no ar e presentes na superfície, liberando sua carga útil de ROS e causando a inativação de microrganismos (Fig. 1d). Esses estudos iniciais também mostraram que os EWNS podem interagir e inativar diversas bactérias gram-negativas e gram-positivas, incluindo micobactérias, em superfícies e no ar. A microscopia eletrônica de transmissão mostrou que a inativação foi causada pela ruptura da membrana celular. Além disso, estudos de inalação aguda demonstraram que altas doses de EWNS não causam danos ou inflamação pulmonar 8 .
(a) A eletropulverização ocorre quando uma alta voltagem é aplicada entre um tubo capilar contendo líquido e um contraeletrodo. (b) A aplicação de alta pressão resulta em dois fenômenos diferentes: (i) eletropulverização de água e (ii) formação de espécies reativas de oxigênio (íons) presas no EWNS. (c) A estrutura única do EWNS. (d) Devido à sua natureza em nanoescala, os EWNS são altamente móveis e podem interagir com patógenos transportados pelo ar.
A capacidade da plataforma antimicrobiana EWNS de inativar microrganismos de origem alimentar na superfície de alimentos frescos também foi demonstrada recentemente. Foi demonstrado também que a carga superficial de EWNS em combinação com um campo elétrico pode ser usada para atingir a entrega direcionada. Além disso, os resultados preliminares para tomates orgânicos após uma exposição de 90 minutos a um EWNS de cerca de 50.000 #/cm3 foram encorajadores, com vários microrganismos de origem alimentar, como E. coli e Listeria 11, observados. Além disso, testes organolépticos preliminares não mostraram efeitos sensoriais em comparação com tomates de controle. Embora esses resultados iniciais de inativação sejam encorajadores para aplicações de segurança alimentar, mesmo em doses muito baixas de EWNS de 50.000 #/cc, veja, é claro que um maior potencial de inativação seria mais benéfico para reduzir ainda mais o risco de infecção e deterioração.
Aqui, concentraremos nossa pesquisa no desenvolvimento de uma plataforma de geração de EWNS para permitir o ajuste fino dos parâmetros de síntese e a otimização das propriedades físico-químicas dos EWNS, a fim de aprimorar seu potencial antibacteriano. Em particular, a otimização se concentrou no aumento da carga superficial (para melhorar a entrega direcionada) e do teor de ROS (para melhorar a eficiência de inativação). Caracterizaremos propriedades físico-químicas otimizadas (tamanho, carga e teor de ROS) utilizando métodos analíticos modernos e microrganismos alimentares comuns, como E.
O EVNS foi sintetizado por eletropulverização e ionização simultâneas de água de alta pureza (18 MΩ cm–1). O nebulizador elétrico 12 é normalmente usado para a atomização de líquidos e a síntese de partículas de polímeros e cerâmicas 13 e fibras 14 de tamanho controlado.
Conforme detalhado em publicações anteriores 8, 9, 10, 11, em um experimento típico, uma alta voltagem foi aplicada entre um capilar metálico e um contraeletrodo aterrado. Durante esse processo, dois fenômenos diferentes ocorrem: i) eletrospray e ii) ionização da água. Um forte campo elétrico entre os dois eletrodos faz com que cargas negativas se acumulem na superfície da água condensada, resultando na formação de cones de Taylor. Como resultado, gotículas de água altamente carregadas são formadas, que continuam a se fragmentar em partículas menores, como na teoria de Rayleigh16. Ao mesmo tempo, fortes campos elétricos fazem com que algumas moléculas de água se dividam e retirem elétrons (ionizem), o que leva à formação de uma grande quantidade de espécies reativas de oxigênio (ROS)17. ROS18 gerados simultaneamente foram encapsulados em EWNS (Fig. 1c).
A figura 2a mostra o sistema de geração de EWNS desenvolvido e utilizado na síntese de EWNS neste estudo. Água purificada armazenada em um frasco fechado foi alimentada através de um tubo de Teflon (diâmetro interno de 2 mm) em uma agulha de aço inoxidável de 30G (capilar metálico). O fluxo de água é controlado pela pressão do ar dentro do frasco, conforme mostrado na Figura 2b. A agulha é montada em um console de Teflon e pode ser ajustada manualmente a uma certa distância do contraeletrodo. O contraeletrodo é um disco de alumínio polido com um furo no centro para amostragem. Abaixo do contraeletrodo há um funil de amostragem de alumínio, que é conectado ao restante da configuração experimental por meio de uma porta de amostragem (Fig. 2b). Para evitar o acúmulo de carga que poderia interromper a operação do amostrador, todos os componentes do amostrador são aterrados eletricamente.
(a) Sistema de geração de nanoestrutura de água projetada (EWNS). (b) Corte transversal do amostrador e eletrospray, mostrando os parâmetros mais importantes. (c) Configuração experimental para inativação de bactérias.
O sistema de geração de EWNS descrito acima é capaz de alterar os principais parâmetros operacionais para facilitar o ajuste fino das propriedades de EWNS. Ajuste a tensão aplicada (V), a distância entre a agulha e o contraeletrodo (L) e o fluxo de água (φ) através do capilar para ajustar as características de EWNS. Símbolo usado para representar diferentes combinações: [V (kV), L (cm)]. Ajuste o fluxo de água para obter um cone de Taylor estável de um determinado conjunto [V, L]. Para os fins deste estudo, o diâmetro da abertura do contraeletrodo (D) foi mantido em 1,29 cm (0,5 polegada).
Devido à geometria limitada e à assimetria, a intensidade do campo elétrico não pode ser calculada a partir de princípios básicos. Em vez disso, o software QuickField™ (Svendborg, Dinamarca)19 foi utilizado para calcular o campo elétrico. O campo elétrico não é uniforme, portanto, o valor do campo elétrico na ponta do capilar foi usado como valor de referência para várias configurações.
Durante o estudo, diversas combinações de voltagem e distância entre a agulha e o contraeletrodo foram avaliadas em termos de formação do cone de Taylor, estabilidade do cone de Taylor, estabilidade da produção de EWNS e reprodutibilidade. As diversas combinações são apresentadas na Tabela Suplementar S1.
A saída do sistema de geração de EWNS foi conectada diretamente a um Analisador de Tamanho de Partículas de Mobilidade de Varredura (SMPS, Modelo 3936, TSI, Shoreview, MN) para medição da concentração do número de partículas, bem como a um Eletrômetro de Faraday de Aerossol (TSI, Modelo 3068B, Shoreview, MN). ) para correntes de aerossol foi medida conforme descrito em nossa publicação anterior. Tanto o SMPS quanto o eletrômetro de aerossol amostraram a uma vazão de 0,5 L/min (vazão total da amostra 1 L/min). A concentração do número de partículas e o fluxo de aerossol foram medidos por 120 segundos. A medição é repetida 30 vezes. Com base nas medições de corrente, a carga total do aerossol é calculada e a carga média de EWNS é estimada para um determinado número total de partículas EWNS selecionadas. O custo médio de EWNS pode ser calculado usando a Equação (1):
onde IEl é a corrente medida, NSMPS é a concentração digital medida com o SMPS e φEl é a vazão por eletrômetro.
Como a umidade relativa (UR) afeta a carga da superfície, a temperatura e a (UR) foram mantidas constantes durante o experimento em 21°C e 45%, respectivamente.
Microscopia de força atômica (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) e sonda AC260T (Olympus, Tóquio, Japão) foram utilizadas para medir o tamanho e a vida útil do EWNS. A frequência de varredura do AFM foi de 1 Hz, a área de varredura foi de 5 μm × 5 μm e 256 linhas de varredura. Todas as imagens foram submetidas a alinhamento de imagem de primeira ordem usando o software Asylum (intervalo de máscara de 100 nm, limiar de 100 pm).
O funil de teste foi removido e a superfície de mica foi colocada a uma distância de 2,0 cm do contraeletrodo por um tempo médio de 120 s para evitar aglomeração de partículas e formação de gotículas irregulares na superfície da mica. O EWNS foi pulverizado diretamente sobre a superfície da mica recém-cortada (Ted Pella, Redding, CA). Imagem da superfície da mica imediatamente após a pulverização catódica por AFM. O ângulo de contato da superfície da mica recém-cortada não modificada é próximo de 0°, então o EVNS é distribuído na superfície da mica na forma de uma cúpula. O diâmetro (a) e a altura (h) das gotículas em difusão foram medidos diretamente da topografia do AFM e usados ​​para calcular o volume de difusão em cúpula do EWNS usando nosso método previamente validado. Assumindo que os EWNS a bordo têm o mesmo volume, o diâmetro equivalente pode ser calculado usando a Equação (2):
Com base em nosso método desenvolvido anteriormente, uma armadilha de spin de ressonância de spin de elétrons (ESR) foi usada para detectar a presença de intermediários radicais de curta duração em EWNS. Aerossóis foram borbulhados através de um aspersor Midget de 650 μm (Ace Glass, Vineland, NJ) contendo uma solução 235 mM de DEPMPO(5-(dietoxifosforil)-5-metil-1-pirrolina-N-óxido) (Oxis International Inc.). Portland, Oregon). Todas as medições de ESR foram realizadas usando um espectrômetro Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, EUA) e uma célula de painel plano. O software Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, EUA) foi usado para coletar e analisar os dados. A determinação das características do ROS foi realizada apenas para um conjunto de condições operacionais [-6,5 kV, 4,0 cm]. As concentrações de EWNS foram medidas usando o SMPS após contabilizar as perdas de EWNS no impactador.
Os níveis de ozônio foram monitorados usando um 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Para todas as propriedades EWNS, o valor médio é usado como valor de medição e o desvio padrão é usado como erro de medição. Testes t foram realizados para comparar os valores dos atributos EWNS otimizados com os valores correspondentes do EWNS base.
A Figura 2c mostra um sistema de "puxada" de precipitação eletrostática (EPES) previamente desenvolvido e caracterizado que pode ser usado para entrega direcionada de EWNS na superfície. O EPES usa cargas EVNS que podem ser "guiadas" diretamente para a superfície do alvo sob a influência de um forte campo elétrico. Detalhes do sistema EPES são apresentados em uma publicação recente de Pyrgiotakis et al. 11 . Assim, o EPES consiste em uma câmara de PVC impressa em 3D com extremidades cônicas e contém duas placas de metal paralelas de aço inoxidável (aço inoxidável 304, revestido de espelho) no centro, a 15,24 cm de distância. As placas foram conectadas a uma fonte externa de alta tensão (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), a placa inferior estava sempre conectada à tensão positiva e a placa superior estava sempre conectada ao aterramento (aterramento flutuante). As paredes da câmara são cobertas com papel alumínio, que é aterrado eletricamente para evitar perda de partículas. A câmara tem uma porta de carregamento frontal selada que permite que as superfícies de teste sejam colocadas em suportes de plástico que as elevam acima da placa de metal inferior para evitar interferência de alta tensão.
A eficiência de deposição de EWNS em EPES foi calculada de acordo com um protocolo desenvolvido anteriormente detalhado na Figura Suplementar S111.
Como câmara de controle, uma segunda câmara de fluxo cilíndrica foi conectada em série ao sistema EPES, na qual um filtro HEPA intermediário foi usado para remover o EWNS. Como mostrado na Figura 2c, o aerossol de EWNS foi bombeado através de duas câmaras integradas. O filtro entre a sala de controle e o EPES remove qualquer EWNS restante, resultando na mesma temperatura (T), umidade relativa (UR) e níveis de ozônio.
Foi descoberto que importantes microrganismos transmitidos por alimentos contaminam alimentos frescos, como E. coli (ATCC #27325), indicador fecal, Salmonella enterica (ATCC #53647), patógeno transmitido por alimentos, Listeria harmless (ATCC #33090), substituto da Listeria monocytogenes patogênica, derivado da ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), um substituto para levedura deteriorante e uma bactéria inativada mais resistente, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Compre caixas aleatórias de tomates-uva orgânicos no mercado local e refrigere a 4 °C até o uso (até 3 dias). Os tomates experimentais eram todos do mesmo tamanho, com cerca de 1,2 cm de diâmetro.
Os protocolos de cultura, inoculação, exposição e contagem de colônias são detalhados em nossa publicação anterior e detalhados nos Dados Suplementares. A eficácia do EWNS foi avaliada pela exposição de tomates inoculados a 40.000 #/cm3 por 45 minutos. Resumidamente, três tomates foram usados ​​para avaliar os microrganismos sobreviventes no tempo t = 0 min. Três tomates foram colocados em EPES e expostos ao EWNS a 40.000 #/cc (tomates expostos ao EWNS) e os três restantes foram colocados na câmara de controle (tomates controle). Não foi realizado processamento adicional de tomates em ambos os grupos. Os tomates expostos ao EWNS e os tomates controle foram removidos após 45 minutos para avaliar o efeito do EWNS.
Cada experimento foi realizado em triplicata. A análise dos dados foi realizada de acordo com o protocolo descrito em Dados Suplementares.
Os mecanismos de inativação foram avaliados pela sedimentação de amostras expostas de EWNS (45 min a 40.000 #/cm³ de concentração de aerossol de EWNS) e amostras não irradiadas de bactérias inofensivas E. coli, Salmonella enterica e Lactobacillus. As partículas foram fixadas em 2,5% de glutaraldeído, 1,25% de paraformaldeído e 0,03% de ácido pícrico em tampão cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,4) por 2 horas à temperatura ambiente. Após a lavagem, pós-fixação com 1% de tetróxido de ósmio (OsO4)/1,5% de ferrocianeto de potássio (KFeCN6) por 2 horas, lavagem 3 vezes em água e incubação em 1% de acetato de uranila por 1 hora, depois lavagem duas vezes em água e desidratação por 10 minutos em álcool 50%, 70%, 90% e 100%. As amostras foram então colocadas em óxido de propileno por 1 hora e impregnadas com uma mistura 1:1 de óxido de propileno e TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). As amostras foram incluídas em TAAB Epon e polimerizadas a 60 °C por 48 horas. A resina granular curada foi cortada e visualizada por MET usando um microscópio eletrônico de transmissão convencional JEOL 1200EX (JEOL, Tóquio, Japão) equipado com uma câmera CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, EUA).
Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Para cada ponto de tempo, lavagens bacterianas foram semeadas em triplicata, resultando em um total de nove pontos de dados por ponto, cuja média foi usada como a concentração bacteriana para aquele microrganismo específico. O desvio padrão foi usado como erro de medição. Todos os pontos contam.
O logaritmo da diminuição da concentração de bactérias em relação a t = 0 min foi calculado pela seguinte fórmula:
onde C0 é a concentração de bactérias na amostra de controle no tempo 0 (ou seja, após a superfície ter secado, mas antes de ser colocada na câmara) e Cn é a concentração de bactérias na superfície após n minutos de exposição.
Para levar em conta a degradação natural das bactérias durante a exposição de 45 minutos, a redução do logaritmo em comparação ao controle após 45 minutos também foi calculada da seguinte forma:
onde Cn é a concentração de bactérias na amostra de controle no instante n e Cn-Controle é a concentração de bactérias de controle no instante n. Os dados são apresentados como uma redução logarítmica em comparação ao controle (sem exposição a EWNS).
Durante o estudo, diversas combinações de voltagem e distância entre a agulha e o contraeletrodo foram avaliadas em termos de formação do cone de Taylor, estabilidade do cone de Taylor, estabilidade da produção de EWNS e reprodutibilidade. As diversas combinações são apresentadas na Tabela Suplementar S1. Dois casos que apresentaram propriedades estáveis ​​e reprodutíveis (cone de Taylor, geração de EWNS e estabilidade ao longo do tempo) foram selecionados para um estudo abrangente. Na Figura 3, são apresentados os resultados para carga, tamanho e conteúdo de ROS em ambos os casos. Os resultados também estão resumidos na Tabela 1. Para referência, tanto a Figura 3 quanto a Tabela 1 incluem as propriedades dos EWNS não otimizados previamente sintetizados8, 9, 10 e 11 (EWNS de linha de base). Os cálculos de significância estatística utilizando um teste t bicaudal são republicados na Tabela Suplementar S2. Além disso, dados adicionais incluem estudos sobre o efeito do diâmetro do furo de amostragem do contraeletrodo (D) e da distância entre o eletrodo terra e a ponta (L) (Figuras Suplementares S2 e S3).
(ac) Distribuição de tamanho medida por AFM. (df) Característica de carga de superfície. (g) Caracterização ROS do EPR.
Também é importante observar que, para todas as condições acima, a corrente de ionização medida ficou entre 2 e 6 μA e a tensão entre -3,8 e -6,5 kV, resultando em um consumo de energia inferior a 50 mW para este único módulo de contato de geração de EWNS. Embora o EWNS tenha sido sintetizado sob alta pressão, os níveis de ozônio foram muito baixos, nunca ultrapassando 60 ppb.
A Figura Suplementar S4 mostra os campos elétricos simulados para os cenários [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. Para os cenários [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], os cálculos de campo são 2 × 105 V/m e 4,7 × 105 V/m, respectivamente. Isso é esperado, visto que no segundo caso a relação tensão-distância é muito maior.
Na fig. 3a,b mostra o diâmetro EWNS medido com o AFM8. Os diâmetros EWNS médios calculados foram 27 nm e 19 nm para os esquemas [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. Para os cenários [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], os desvios-padrão geométricos das distribuições são 1,41 e 1,45, respectivamente, indicando uma distribuição de tamanho estreita. Tanto o tamanho médio quanto o desvio-padrão geométrico estão muito próximos do EWNS de base, em 25 nm e 1,41, respectivamente. Na fig. 3c mostra a distribuição de tamanho do EWNS de base medido usando o mesmo método sob as mesmas condições.
Na fig. 3d,e mostra os resultados da caracterização de carga. Os dados são medições médias de 30 medições simultâneas de concentração (#/cm3) e corrente (I). A análise mostra que a carga média no EWNS é de 22 ± 6 e- e 44 ± 6 e- para [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. Eles têm cargas de superfície significativamente maiores em comparação com o EWNS de linha de base (10 ± 2 e-), duas vezes maiores que o cenário [-6,5 kV, 4,0 cm] e quatro vezes maiores que o [-3,8 kV, 0,5 cm]. A Figura 3f mostra os dados de carga para o EWNS de linha de base.
A partir dos mapas de concentração do número EWNS (Figuras Suplementares S5 e S6), pode-se observar que o cenário [-6,5 kV, 4,0 cm] apresenta significativamente mais partículas do que o cenário [-3,8 kV, 0,5 cm]. Vale ressaltar também que a concentração do número EWNS foi monitorada por até 4 horas (Figuras Suplementares S5 e S6), onde a estabilidade da geração EWNS apresentou os mesmos níveis de concentração do número de partículas em ambos os casos.
A figura 3g mostra o espectro EPR após a subtração do controle EWNS otimizado (fundo) em [-6,5 kV, 4,0 cm]. Os espectros de ROS também foram comparados com o cenário EWNS de base em um trabalho publicado anteriormente. O número de EWNS reagindo com armadilhas de spin foi calculado em 7,5 × 104 EWNS/s, o que é semelhante ao EWNS de base publicado anteriormente8. Os espectros EPR mostraram claramente a presença de dois tipos de ROS, com O2- sendo a espécie predominante e OH• sendo menos abundante. Além disso, uma comparação direta das intensidades de pico mostrou que o EWNS otimizado tinha um conteúdo de ROS significativamente maior em comparação com o EWNS de base.
A Fig. 4 mostra a eficiência de deposição de EWNS em EPES. Os dados também estão resumidos na Tabela I e comparados com os dados originais de EWNS. Para ambos os casos de EUNS, a deposição é próxima de 100%, mesmo em baixa tensão de 3,0 kV. Tipicamente, 3,0 kV são suficientes para 100% de deposição, independentemente da mudança na carga superficial. Sob as mesmas condições, a eficiência de deposição de EWNS de base foi de apenas 56% devido à sua menor carga (média de 10 elétrons por EWNS).
A Fig. 5 e a Tabela 2 resumem o valor de inativação de microrganismos inoculados na superfície de tomates após exposição a cerca de 40.000 #/cm³ de EWNS por 45 minutos no modo ótimo [-6,5 kV, 4,0 cm]. E. coli e Lactobacillus innocuous inoculados apresentaram uma redução significativa de 3,8 logs durante a exposição de 45 minutos. Nas mesmas condições, S. enterica apresentou uma redução de 2,2 logs, enquanto S. cerevisiae e M. parafortutum apresentaram uma redução de 1,0 log.
As micrografias eletrônicas (Figura 6) mostram as alterações físicas induzidas por EWNS em células inofensivas de Escherichia coli, Streptococcus e Lactobacillus, levando à sua inativação. As bactérias de controle apresentavam membranas celulares intactas, enquanto as bactérias expostas apresentavam membranas externas danificadas.
Imagens de microscopia eletrônica de bactérias controle e expostas revelaram danos à membrana.
Os dados sobre as propriedades físico-químicas do EWNS otimizado mostram coletivamente que as propriedades (carga superficial e conteúdo de ROS) do EWNS foram significativamente melhoradas em comparação com os dados de linha de base do EWNS publicados anteriormente8,9,10,11. Por outro lado, seu tamanho permaneceu na faixa nanométrica, muito semelhante aos resultados relatados anteriormente, permitindo que permanecessem no ar por longos períodos de tempo. A polidispersão observada pode ser explicada por mudanças na carga superficial que determinam o tamanho do EWNS, a aleatoriedade do efeito Rayleigh e a potencial coalescência. No entanto, conforme detalhado por Nielsen et al. 22, a alta carga superficial reduz a evaporação aumentando efetivamente a energia/tensão superficial da gota d'água. Em nossa publicação anterior8, essa teoria foi confirmada experimentalmente para microgotas 22 e EWNS. A perda de carga durante o tempo extra também pode afetar o tamanho e contribuir para a distribuição de tamanho observada.
Além disso, a carga por estrutura é de cerca de 22-44 e-, dependendo da situação, o que é significativamente maior em comparação com o EWNS básico, que possui uma carga média de 10 ± 2 elétrons por estrutura. No entanto, deve-se notar que esta é a carga média do EWNS. Seto et al. demonstraram que a carga é heterogênea e segue uma distribuição log-normal21. Em comparação com nosso trabalho anterior, dobrar a carga superficial duplica a eficiência de deposição no sistema EPES para quase 100%11.