Σας ευχαριστούμε που επισκεφθήκατε το Nature.com. Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS. Για την καλύτερη δυνατή εμπειρία, σας συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη Λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Εν τω μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα αποδώσουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Πρόσφατα, αναπτύχθηκε μια πλατφόρμα αντιμικροβιακών χωρίς χημικές ουσίες, βασισμένη στη νανοτεχνολογία που χρησιμοποιεί τεχνητές νανοδομές νερού (EWNS). Τα EWNS έχουν υψηλό επιφανειακό φορτίο και είναι κορεσμένα με δραστικά είδη οξυγόνου (ROS) που μπορούν να αλληλεπιδράσουν και να απενεργοποιήσουν έναν αριθμό μικροοργανισμών, συμπεριλαμβανομένων των τροφιμογενών παθογόνων. Εδώ αποδεικνύεται ότι οι ιδιότητές τους κατά τη σύνθεση μπορούν να βελτιωθούν και να βελτιστοποιηθούν για την περαιτέρω ενίσχυση του αντιβακτηριακού τους δυναμικού. Η εργαστηριακή πλατφόρμα EWNS σχεδιάστηκε για να βελτιώνει τις ιδιότητες των EWNS αλλάζοντας τις παραμέτρους σύνθεσης. Χαρακτηρισμός των ιδιοτήτων των EWNS (φορτίο, μέγεθος και περιεκτικότητα σε ROS) χρησιμοποιώντας σύγχρονες αναλυτικές μεθόδους. Επιπλέον, αξιολογήθηκαν για το δυναμικό μικροβιακής απενεργοποίησης έναντι τροφιμογενών μικροοργανισμών όπως Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum και Saccharomyces cerevisiae. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ καταδεικνύουν ότι οι ιδιότητες των EWNS μπορούν να βελτιωθούν κατά τη σύνθεση, με αποτέλεσμα μια εκθετική αύξηση στην αποτελεσματικότητα της απενεργοποίησης. Συγκεκριμένα, το επιφανειακό φορτίο αυξήθηκε κατά ένα συντελεστή τέσσερα και τα δραστικά είδη οξυγόνου αυξήθηκαν. Ο ρυθμός απομάκρυνσης μικροβίων ήταν μικροβιακά εξαρτώμενος και κυμαινόταν από 1,0 έως 3,8 log μετά από έκθεση 45 λεπτών σε δόση αερολύματος 40.000 #/cc EWNS.
Η μικροβιακή μόλυνση είναι η κύρια αιτία των τροφιμογενών ασθενειών που προκαλούνται από την κατάποση παθογόνων ή των τοξινών τους. Μόνο στις Ηνωμένες Πολιτείες, οι τροφιμογενείς ασθένειες προκαλούν περίπου 76 εκατομμύρια ασθένειες, 325.000 εισαγωγές σε νοσοκομεία και 5.000 θανάτους κάθε χρόνο1. Επιπλέον, το Υπουργείο Γεωργίας των Ηνωμένων Πολιτειών (USDA) εκτιμά ότι η αυξημένη κατανάλωση φρέσκων προϊόντων ευθύνεται για το 48% όλων των αναφερόμενων τροφιμογενών ασθενειών στις Ηνωμένες Πολιτείες2. Το κόστος των ασθενειών και των θανάτων που προκαλούνται από τροφιμογενείς παθογόνους παράγοντες στις Ηνωμένες Πολιτείες είναι πολύ υψηλό, με εκτιμήσεις από τα Κέντρα Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων (CDC) σε περισσότερα από 15,6 δισεκατομμύρια δολάρια ΗΠΑ ετησίως3.
Επί του παρόντος, οι χημικές4, ακτινοβολίες5 και θερμικές6 αντιμικροβιακές παρεμβάσεις για τη διασφάλιση της ασφάλειας των τροφίμων πραγματοποιούνται κυρίως σε περιορισμένα κρίσιμα σημεία ελέγχου (CCP) κατά μήκος της αλυσίδας παραγωγής (συνήθως μετά τη συγκομιδή ή/και κατά τη συσκευασία) και όχι συνεχώς. Συνεπώς, είναι επιρρεπή σε διασταυρούμενη μόλυνση. 7. Ο καλύτερος έλεγχος των τροφιμογενών ασθενειών και της αλλοίωσης των τροφίμων απαιτεί αντιμικροβιακές παρεμβάσεις που μπορούν ενδεχομένως να εφαρμοστούν σε όλο το φάσμα από το αγρόκτημα στο τραπέζι, μειώνοντας παράλληλα τις περιβαλλοντικές επιπτώσεις και το κόστος.
Πρόσφατα, αναπτύχθηκε μια αντιμικροβιακή πλατφόρμα χωρίς χημικές ουσίες, βασισμένη στη νανοτεχνολογία, η οποία μπορεί να απενεργοποιήσει επιφανειακά και αερομεταφερόμενα βακτήρια χρησιμοποιώντας τεχνητές νανοδομές νερού (EWNS). Η EWNS συντέθηκε χρησιμοποιώντας δύο παράλληλες διαδικασίες, ηλεκτροψεκασμό και ιονισμό νερού (Εικ. 1α). Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι οι EWNS έχουν ένα μοναδικό σύνολο φυσικών και βιολογικών ιδιοτήτων8,9,10. Οι EWNS έχουν κατά μέσο όρο 10 ηλεκτρόνια ανά δομή και μέσο μέγεθος νανοκλίμακας 25 nm (Εικ. 1β,γ)8,9,10. Επιπλέον, ο συντονισμός σπιν ηλεκτρονίων (ESR) έδειξε ότι οι EWNS περιέχουν μεγάλη ποσότητα δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), κυρίως ρίζες υδροξυλίου (OH•) και υπεροξειδίου (O2-) (Εικ. 1γ)8. Οι EVNS βρίσκονται στον αέρα για μεγάλο χρονικό διάστημα και μπορούν να συγκρουστούν με μικροοργανισμούς που αιωρούνται στον αέρα και υπάρχουν στην επιφάνεια, απελευθερώνοντας το ωφέλιμο φορτίο ROS τους και προκαλώντας απενεργοποίηση μικροοργανισμών (Εικ. 1δ). Αυτές οι πρώιμες μελέτες έδειξαν επίσης ότι το EWNS μπορεί να αλληλεπιδράσει και να απενεργοποιήσει διάφορα αρνητικά κατά Gram και θετικά κατά Gram βακτήρια, συμπεριλαμβανομένων των μυκοβακτηρίων, σε επιφάνειες και στον αέρα. Η ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης έδειξε ότι η απενεργοποίηση προκλήθηκε από διαταραχή της κυτταρικής μεμβράνης. Επιπλέον, μελέτες οξείας εισπνοής έχουν δείξει ότι οι υψηλές δόσεις EWNS δεν προκαλούν βλάβη στους πνεύμονες ή φλεγμονή 8.
(α) Ο ηλεκτροψεκασμός συμβαίνει όταν εφαρμόζεται υψηλή τάση μεταξύ ενός τριχοειδούς σωλήνα που περιέχει υγρό και ενός αντίθετου ηλεκτροδίου. (β) Η εφαρμογή υψηλής πίεσης έχει ως αποτέλεσμα δύο διαφορετικά φαινόμενα: (i) ηλεκτροψεκασμό νερού και (ii) σχηματισμό δραστικών ειδών οξυγόνου (ιόντων) παγιδευμένων στο EWNS. (γ) Η μοναδική δομή του EWNS. (δ) Λόγω της νανοκλίμακας φύσης του, το EWNS είναι ιδιαίτερα κινητικό και μπορεί να αλληλεπιδράσει με αερομεταφερόμενα παθογόνα.
Η ικανότητα της αντιμικροβιακής πλατφόρμας EWNS να απενεργοποιεί τους τροφιμογενείς μικροοργανισμούς στην επιφάνεια των φρέσκων τροφίμων έχει επίσης αποδειχθεί πρόσφατα. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι το επιφανειακό φορτίο του EWNS σε συνδυασμό με ένα ηλεκτρικό πεδίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επίτευξη στοχευμένης χορήγησης. Επιπλέον, τα προκαταρκτικά αποτελέσματα για τις βιολογικές ντομάτες μετά από έκθεση 90 λεπτών σε EWNS περίπου 50.000 #/cm3 ήταν ενθαρρυντικά, με την παρατήρηση διαφόρων τροφιμογενών μικροοργανισμών όπως το E. coli και η Listeria 11. Επιπλέον, οι προκαταρκτικές οργανοληπτικές δοκιμές δεν έδειξαν αισθητηριακές επιδράσεις σε σύγκριση με τις ντομάτες ελέγχου. Αν και αυτά τα αρχικά αποτελέσματα απενεργοποίησης είναι ενθαρρυντικά για εφαρμογές ασφάλειας τροφίμων ακόμη και σε πολύ χαμηλές δόσεις EWNS των 50.000#/cc, είναι σαφές ότι ένα υψηλότερο δυναμικό απενεργοποίησης θα ήταν πιο ωφέλιμο για την περαιτέρω μείωση του κινδύνου μόλυνσης και αλλοίωσης.
Εδώ, θα εστιάσουμε την έρευνά μας στην ανάπτυξη μιας πλατφόρμας δημιουργίας EWNS που θα επιτρέψει τη λεπτή ρύθμιση των παραμέτρων σύνθεσης και τη βελτιστοποίηση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων των EWNS για την ενίσχυση του αντιβακτηριακού τους δυναμικού. Συγκεκριμένα, η βελτιστοποίηση έχει επικεντρωθεί στην αύξηση του επιφανειακού τους φορτίου (για βελτίωση της στοχευμένης χορήγησης) και της περιεκτικότητας σε ROS (για βελτίωση της αποτελεσματικότητας απενεργοποίησης). Χαρακτηρισμός βελτιστοποιημένων φυσικοχημικών ιδιοτήτων (μέγεθος, φορτίο και περιεκτικότητα σε ROS) χρησιμοποιώντας σύγχρονες αναλυτικές μεθόδους και χρήση κοινών μικροοργανισμών τροφίμων όπως το E. .
Το EVNS συντέθηκε με ταυτόχρονο ηλεκτροψεκασμό και ιονισμό νερού υψηλής καθαρότητας (18 MΩ cm–1). Ο ηλεκτρικός νεφελοποιητής 12 χρησιμοποιείται συνήθως για τον ψεκασμό υγρών και τη σύνθεση πολυμερών και κεραμικών σωματιδίων 13 και ινών 14 ελεγχόμενου μεγέθους.
Όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε προηγούμενες δημοσιεύσεις 8, 9, 10, 11, σε ένα τυπικό πείραμα, εφαρμόστηκε υψηλή τάση μεταξύ ενός μεταλλικού τριχοειδούς και ενός γειωμένου αντίθετου ηλεκτροδίου. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, συμβαίνουν δύο διαφορετικά φαινόμενα: i) ηλεκτροψεκασμός και ii) ιονισμός νερού. Ένα ισχυρό ηλεκτρικό πεδίο μεταξύ των δύο ηλεκτροδίων προκαλεί τη συσσώρευση αρνητικών φορτίων στην επιφάνεια του συμπυκνωμένου νερού, με αποτέλεσμα τον σχηματισμό κώνων Taylor. Ως αποτέλεσμα, σχηματίζονται σταγονίδια νερού με υψηλό φορτίο, τα οποία συνεχίζουν να διασπώνται σε μικρότερα σωματίδια, όπως στη θεωρία Rayleigh16. Ταυτόχρονα, ισχυρά ηλεκτρικά πεδία προκαλούν τη διάσπαση και την απογύμνωση ηλεκτρονίων (ιονισμό) από ορισμένα μόρια νερού, γεγονός που οδηγεί στον σχηματισμό μεγάλης ποσότητας δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS)17. Το ταυτόχρονα παραγόμενο ROS18 ενθυλακώθηκε σε EWNS (Εικ. 1c).
Στο σχήμα 2α φαίνεται το σύστημα παραγωγής EWNS που αναπτύχθηκε και χρησιμοποιήθηκε στη σύνθεση EWNS σε αυτή τη μελέτη. Καθαρισμένο νερό αποθηκευμένο σε κλειστή φιάλη τροφοδοτήθηκε μέσω ενός σωλήνα Teflon (εσωτερικής διαμέτρου 2 mm) σε μια βελόνα από ανοξείδωτο χάλυβα 30G (μεταλλικό τριχοειδές). Η ροή του νερού ελέγχεται από την πίεση του αέρα μέσα στη φιάλη, όπως φαίνεται στο σχήμα 2β. Η βελόνα είναι τοποθετημένη σε μια κονσόλα Teflon και μπορεί να ρυθμιστεί χειροκίνητα σε μια ορισμένη απόσταση από το αντίθετο ηλεκτρόδιο. Το αντίθετο ηλεκτρόδιο είναι ένας δίσκος από γυαλισμένο αλουμίνιο με μια οπή στο κέντρο για δειγματοληψία. Κάτω από το αντίθετο ηλεκτρόδιο υπάρχει μια χοάνη δειγματοληψίας αλουμινίου, η οποία συνδέεται με την υπόλοιπη πειραματική διάταξη μέσω μιας θύρας δειγματοληψίας (Εικ. 2β). Για να αποφευχθεί η συσσώρευση φορτίου που θα μπορούσε να διαταράξει τη λειτουργία του δειγματολήπτη, όλα τα εξαρτήματα του δειγματολήπτη είναι ηλεκτρικά γειωμένα.
(α) Σύστημα Παραγωγής Νανοδομών Τεχνολογικού Νερού (EWNS). (β) Διατομή του δειγματολήπτη και του ηλεκτροψεκασμού, που δείχνει τις πιο σημαντικές παραμέτρους. (γ) Πειραματική διάταξη για την απενεργοποίηση βακτηρίων.
Το σύστημα παραγωγής EWNS που περιγράφεται παραπάνω είναι ικανό να αλλάζει βασικές λειτουργικές παραμέτρους για να διευκολύνει τη λεπτή ρύθμιση των ιδιοτήτων του EWNS. Ρυθμίστε την εφαρμοζόμενη τάση (V), την απόσταση μεταξύ της βελόνας και του αντίθετου ηλεκτροδίου (L) και τη ροή του νερού (φ) μέσω του τριχοειδούς για να λεπτορυθμίσετε τα χαρακτηριστικά του EWNS. Σύμβολο που χρησιμοποιείται για να αναπαραστήσει διαφορετικούς συνδυασμούς: [V (kV), L (cm)]. Ρυθμίστε τη ροή του νερού για να λάβετε έναν σταθερό κώνο Taylor ενός συγκεκριμένου συνόλου [V, L]. Για τους σκοπούς της παρούσας μελέτης, η διάμετρος του ανοίγματος του αντίθετου ηλεκτροδίου (D) διατηρήθηκε στις 0,5 ίντσες (1,29 cm).
Λόγω της περιορισμένης γεωμετρίας και ασυμμετρίας, η ένταση του ηλεκτρικού πεδίου δεν μπορεί να υπολογιστεί από τις πρώτες αρχές. Αντ' αυτού, χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό QuickField™ (Svendborg, Δανία)19 για τον υπολογισμό του ηλεκτρικού πεδίου. Το ηλεκτρικό πεδίο δεν είναι ομοιόμορφο, επομένως η τιμή του ηλεκτρικού πεδίου στην άκρη του τριχοειδούς χρησιμοποιήθηκε ως τιμή αναφοράς για διάφορες διαμορφώσεις.
Κατά τη διάρκεια της μελέτης, αξιολογήθηκαν διάφοροι συνδυασμοί τάσης και απόστασης μεταξύ της βελόνας και του αντίθετου ηλεκτροδίου όσον αφορά τον σχηματισμό κώνου Taylor, τη σταθερότητα του κώνου Taylor, τη σταθερότητα παραγωγής EWNS και την αναπαραγωγιμότητα. Διάφοροι συνδυασμοί παρουσιάζονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1.
Η έξοδος του συστήματος παραγωγής EWNS συνδέθηκε απευθείας με έναν Αναλυτή Μεγέθους Σωματιδίων Σάρωσης Κινητικότητας (SMPS, Model 3936, TSI, Shoreview, MN) για τη μέτρηση της συγκέντρωσης αριθμού σωματιδίων, καθώς και με ένα Ηλεκτρόμετρο Faraday Αερολυμάτων (TSI, Model 3068B, Shoreview, MN). ) για τα ρεύματα αερολυμάτων μετρήθηκε όπως περιγράφεται στην προηγούμενη δημοσίευσή μας. Τόσο το SMPS όσο και το ηλεκτρόμετρο αερολύματος ελήφθησαν δείγματα με ρυθμό ροής 0,5 L/min (συνολική ροή δείγματος 1 L/min). Η αριθμητική συγκέντρωση των σωματιδίων και η ροή αερολύματος μετρήθηκαν για 120 δευτερόλεπτα. Η μέτρηση επαναλαμβάνεται 30 φορές. Με βάση τις μετρήσεις ρεύματος, υπολογίζεται το συνολικό φορτίο αερολύματος και εκτιμάται το μέσο φορτίο EWNS για έναν δεδομένο συνολικό αριθμό επιλεγμένων σωματιδίων EWNS. Το μέσο κόστος του EWNS μπορεί να υπολογιστεί χρησιμοποιώντας την Εξίσωση (1):
όπου IEl είναι το μετρούμενο ρεύμα, NSMPS είναι η ψηφιακή συγκέντρωση που μετριέται με το SMPS και φEl είναι ο ρυθμός ροής ανά ηλεκτρόμετρο.
Επειδή η σχετική υγρασία (RH) επηρεάζει το επιφανειακό φορτίο, η θερμοκρασία και η (RH) διατηρήθηκαν σταθερές κατά τη διάρκεια του πειράματος στους 21°C και 45%, αντίστοιχα.
Για τη μέτρηση του μεγέθους και της διάρκειας ζωής του EWNS χρησιμοποιήθηκαν μικροσκοπία ατομικής δύναμης (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) και ανιχνευτής AC260T (Olympus, Τόκιο, Ιαπωνία). Η συχνότητα σάρωσης AFM ήταν 1 Hz, η περιοχή σάρωσης ήταν 5 μm × 5 μm και 256 γραμμές σάρωσης. Όλες οι εικόνες υποβλήθηκαν σε ευθυγράμμιση εικόνας 1ης τάξης χρησιμοποιώντας το λογισμικό Asylum (εύρος μάσκας 100 nm, όριο 100 pm).
Η δοκιμαστική χοάνη αφαιρέθηκε και η επιφάνεια του μαρμαρυγία τοποθετήθηκε σε απόσταση 2,0 cm από το αντίθετο ηλεκτρόδιο για μέσο χρόνο 120 s για να αποφευχθεί η συσσωμάτωση σωματιδίων και ο σχηματισμός ακανόνιστων σταγονιδίων στην επιφάνεια του μαρμαρυγία. Το EWNS ψεκάστηκε απευθείας στην επιφάνεια του φρεσκοκομμένου μαρμαρυγία (Ted Pella, Redding, CA). Εικόνα της επιφάνειας του μαρμαρυγία αμέσως μετά τον ψεκασμό AFM. Η γωνία επαφής της επιφάνειας του φρεσκοκομμένου μη τροποποιημένου μαρμαρυγία είναι κοντά στις 0°, επομένως το EVNS κατανέμεται στην επιφάνεια του μαρμαρυγία με τη μορφή θόλου. Η διάμετρος (a) και το ύψος (h) των σταγονιδίων διάχυσης μετρήθηκαν απευθείας από την τοπογραφία AFM και χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό του όγκου διάχυσης με θόλο του EWNS χρησιμοποιώντας την προηγουμένως επικυρωμένη μέθοδό μας. Υποθέτοντας ότι τα ενσωματωμένα EWNS έχουν τον ίδιο όγκο, η ισοδύναμη διάμετρος μπορεί να υπολογιστεί χρησιμοποιώντας την Εξίσωση (2):
Με βάση την προηγουμένως αναπτυχθείσα μέθοδό μας, χρησιμοποιήθηκε μια παγίδα σπιν συντονισμού ηλεκτρονίων (ESR) για την ανίχνευση της παρουσίας βραχύβιων ενδιάμεσων ριζών σε EWNS. Αερολύματα διοχετεύθηκαν μέσω ενός ψεκαστή Midget 650 μm (Ace Glass, Vineland, NJ) που περιείχε ένα διάλυμα 235 mM DEPMPO(5-(διαιθοξυφωσφορυλ)-5-μεθυλ-1-πυρρολιν-Ν-οξειδίου) (Oxis International Inc.). Πόρτλαντ, Όρεγκον. Όλες οι μετρήσεις ESR πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματόμετρο Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, ΗΠΑ) και ένα επίπεδο κελί. Το λογισμικό Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, ΗΠΑ) χρησιμοποιήθηκε για τη συλλογή και την ανάλυση των δεδομένων. Ο προσδιορισμός των χαρακτηριστικών του ROS πραγματοποιήθηκε μόνο για ένα σύνολο συνθηκών λειτουργίας [-6,5 kV, 4,0 cm]. Οι συγκεντρώσεις EWNS μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το SMPS αφού λήφθηκαν υπόψη οι απώλειες EWNS στον κρουστήρα.
Τα επίπεδα όζοντος παρακολουθήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Για όλες τις ιδιότητες του EWNS, η μέση τιμή χρησιμοποιείται ως τιμή μέτρησης και η τυπική απόκλιση χρησιμοποιείται ως σφάλμα μέτρησης. Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές T για τη σύγκριση των τιμών των βελτιστοποιημένων χαρακτηριστικών EWNS με τις αντίστοιχες τιμές του βασικού EWNS.
Το Σχήμα 2c δείχνει ένα προηγουμένως αναπτυγμένο και χαρακτηρισμένο σύστημα «έλξης» ηλεκτροστατικής κατακρήμνισης (EPES) που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για στοχευμένη παροχή EWNS στην επιφάνεια. Το EPES χρησιμοποιεί φορτία EVNS που μπορούν να «οδηγηθούν» απευθείας στην επιφάνεια του στόχου υπό την επίδραση ενός ισχυρού ηλεκτρικού πεδίου. Λεπτομέρειες του συστήματος EPES παρουσιάζονται σε πρόσφατη δημοσίευση των Pyrgiotakis et al. 11. Έτσι, το EPES αποτελείται από έναν τρισδιάστατα εκτυπωμένο θάλαμο PVC με κωνικά άκρα και περιέχει δύο παράλληλες μεταλλικές πλάκες από ανοξείδωτο χάλυβα (ανοξείδωτος χάλυβας 304, με επικάλυψη καθρέφτη) στο κέντρο, σε απόσταση 15,24 cm μεταξύ τους. Οι πλάκες συνδέονταν σε μια εξωτερική πηγή υψηλής τάσης (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), η κάτω πλάκα ήταν πάντα συνδεδεμένη με θετική τάση και η άνω πλάκα ήταν πάντα συνδεδεμένη με γείωση (πλωτό έδαφος). Τα τοιχώματα του θαλάμου είναι καλυμμένα με αλουμινόχαρτο, το οποίο είναι ηλεκτρικά γειωμένο για να αποτρέπεται η απώλεια σωματιδίων. Ο θάλαμος διαθέτει μια σφραγισμένη μπροστινή πόρτα φόρτωσης που επιτρέπει την τοποθέτηση των επιφανειών δοκιμής σε πλαστικές βάσεις που τις ανυψώνουν πάνω από την κάτω μεταλλική πλάκα για την αποφυγή παρεμβολών υψηλής τάσης.
Η αποτελεσματικότητα εναπόθεσης του EWNS σε EPES υπολογίστηκε σύμφωνα με ένα προηγουμένως αναπτυγμένο πρωτόκολλο που περιγράφεται λεπτομερώς στο Συμπληρωματικό Σχήμα S111.
Ως θάλαμος ελέγχου, ένας δεύτερος κυλινδρικός θάλαμος ροής συνδέθηκε σε σειρά με το σύστημα EPES, στον οποίο χρησιμοποιήθηκε ένα ενδιάμεσο φίλτρο HEPA για την αφαίρεση του EWNS. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2γ, το αερόλυμα EWNS αντλήθηκε μέσω δύο ενσωματωμένων θαλάμων. Το φίλτρο μεταξύ του θαλάμου ελέγχου και του EPES αφαιρεί τυχόν εναπομείναντα EWNS, με αποτέλεσμα την ίδια θερμοκρασία (T), σχετική υγρασία (RH) και επίπεδα όζοντος.
Σημαντικοί τροφιμογενείς μικροοργανισμοί έχουν βρεθεί ότι μολύνουν φρέσκα τρόφιμα, όπως το E. coli (ATCC #27325), δείκτης κοπράνων, Salmonella enterica (ATCC #53647), τροφιμογενές παθογόνο, Listeria harmless (ATCC #33090), υποκατάστατο της παθογόνου Listeria monocytogenes, που προέρχεται από το ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), ένα υποκατάστατο της μαγιάς αλλοίωσης, και ένα πιο ανθεκτικό αδρανοποιημένο βακτήριο, το Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Αγοράστε τυχαία κουτιά με βιολογικές ντομάτες από την τοπική σας αγορά και βάλτε τις στο ψυγείο στους 4°C μέχρι να τις χρησιμοποιήσετε (έως και 3 ημέρες). Οι πειραματικές ντομάτες είχαν όλες το ίδιο μέγεθος, περίπου 1,25 εκατοστά σε διάμετρο.
Τα πρωτόκολλα καλλιέργειας, εμβολιασμού, έκθεσης και καταμέτρησης αποικιών περιγράφονται λεπτομερώς στην προηγούμενη δημοσίευσή μας και περιγράφονται λεπτομερώς στα Συμπληρωματικά Δεδομένα. Η αποτελεσματικότητα του EWNS αξιολογήθηκε εκθέτοντας τις εμβολιασμένες ντομάτες σε 40.000 #/cm3 για 45 λεπτά. Εν συντομία, χρησιμοποιήθηκαν τρεις ντομάτες για την αξιολόγηση των επιζώντων μικροοργανισμών σε χρόνο t = 0 λεπτά. Τρεις ντομάτες τοποθετήθηκαν σε EPES και εκτέθηκαν σε EWNS στα 40.000 #/cc (ντομάτες εκτεθειμένες σε EWNS) και οι υπόλοιπες τρεις τοποθετήθηκαν στον θάλαμο ελέγχου (ντομάτες ελέγχου). Δεν πραγματοποιήθηκε περαιτέρω επεξεργασία των ντοματών και στις δύο ομάδες. Οι ντομάτες που εκτέθηκαν σε EWNS και οι ντομάτες ελέγχου αφαιρέθηκαν μετά από 45 λεπτά για να αξιολογηθεί η επίδραση του EWNS.
Κάθε πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν. Η ανάλυση δεδομένων πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται στα Συμπληρωματικά Δεδομένα.
Οι μηχανισμοί απενεργοποίησης αξιολογήθηκαν με καθίζηση εκτεθειμένων δειγμάτων EWNS (45 λεπτά σε συγκέντρωση αερολύματος EWNS 40.000 #/cm3) και μη ακτινοβολημένων δειγμάτων αβλαβών βακτηρίων E. coli, Salmonella enterica και Lactobacillus. Τα σωματίδια σταθεροποιήθηκαν σε 2,5% γλουταραλδεΰδη, 1,25% παραφορμαλδεΰδη και 0,03% πικρικό οξύ σε ρυθμιστικό διάλυμα κακοδυλικού νατρίου 0,1 M (pH 7,4) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά το πλύσιμο, σταθεροποιήθηκαν με 1% τετροξείδιο του οσμίου (OsO4)/1,5% σιδηροκυανιούχο κάλιο (KFeCN6) για 2 ώρες, πλύθηκαν 3 φορές με νερό και επωάστηκαν σε 1% οξικό ουρανύλιο για 1 ώρα, στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με νερό και στη συνέχεια αφυδατώθηκαν για 10 λεπτά σε 50%, 70%, 90%, 100% αλκοόλη. Τα δείγματα στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε προπυλενοξείδιο για 1 ώρα και εμποτίστηκαν με ένα μείγμα 1:1 προπυλενοξειδίου και TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Τα δείγματα ενσωματώθηκαν σε TAAB Epon και πολυμερίστηκαν στους 60°C για 48 ώρες. Η σκληρυμένη κοκκώδης ρητίνη κόπηκε και απεικονίστηκε με TEM χρησιμοποιώντας ένα συμβατικό ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης JEOL 1200EX (JEOL, Τόκιο, Ιαπωνία) εξοπλισμένο με κάμερα AMT 2k CCD (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Μασαχουσέτη, ΗΠΑ).
Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Για κάθε χρονικό σημείο, τα βακτηριακά εκπλύματα εμφυτεύτηκαν εις τριπλούν, με αποτέλεσμα συνολικά εννέα σημεία δεδομένων ανά σημείο, ο μέσος όρος των οποίων χρησιμοποιήθηκε ως βακτηριακή συγκέντρωση για τον συγκεκριμένο μικροοργανισμό. Η τυπική απόκλιση χρησιμοποιήθηκε ως σφάλμα μέτρησης. Όλα τα σημεία μετρώνται.
Ο λογάριθμος της μείωσης της συγκέντρωσης των βακτηρίων σε σύγκριση με t = 0 λεπτά υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο:
όπου C0 είναι η συγκέντρωση βακτηρίων στο δείγμα ελέγχου τη χρονική στιγμή 0 (δηλαδή μετά την ξήρανση της επιφάνειας αλλά πριν τοποθετηθεί στον θάλαμο) και Cn είναι η συγκέντρωση βακτηρίων στην επιφάνεια μετά από n λεπτά έκθεσης.
Για να ληφθεί υπόψη η φυσική αποικοδόμηση των βακτηρίων κατά τη διάρκεια της 45λεπτης έκθεσης, η λογαριθμική μείωση σε σύγκριση με τον έλεγχο μετά από 45 λεπτά υπολογίστηκε επίσης ως εξής:
όπου Cn είναι η συγκέντρωση των βακτηρίων στο δείγμα ελέγχου τη χρονική στιγμή n και Cn-Control είναι η συγκέντρωση των βακτηρίων ελέγχου τη χρονική στιγμή n. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως λογαριθμική μείωση σε σύγκριση με τον έλεγχο (χωρίς έκθεση σε EWNS).
Κατά τη διάρκεια της μελέτης, αξιολογήθηκαν διάφοροι συνδυασμοί τάσης και απόστασης μεταξύ της βελόνας και του αντίθετου ηλεκτροδίου ως προς τον σχηματισμό κώνου Taylor, τη σταθερότητα του κώνου Taylor, τη σταθερότητα παραγωγής EWNS και την αναπαραγωγιμότητα. Διάφοροι συνδυασμοί παρουσιάζονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1. Δύο περιπτώσεις που παρουσιάζουν σταθερές και αναπαραγώγιμες ιδιότητες (κώνος Taylor, παραγωγή EWNS και σταθερότητα με την πάροδο του χρόνου) επιλέχθηκαν για ολοκληρωμένη μελέτη. Στο σχήμα 3, το Σχήμα 3 δείχνει τα αποτελέσματα για το φορτίο, το μέγεθος και την περιεκτικότητα σε ROS και στις δύο περιπτώσεις. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται επίσης στον Πίνακα 1. Για αναφορά, τόσο το Σχήμα 3 όσο και ο Πίνακας 1 περιλαμβάνουν τις ιδιότητες του προηγουμένως συντεθειμένου μη βελτιστοποιημένου EWNS8, 9, 10, 11 (baseline-EWNS). Οι υπολογισμοί στατιστικής σημαντικότητας χρησιμοποιώντας ένα t-test διπλής ουράς αναδημοσιεύονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S2. Επιπλέον, πρόσθετα δεδομένα περιλαμβάνουν μελέτες της επίδρασης της διαμέτρου της οπής δειγματοληψίας του αντίθετου ηλεκτροδίου (D) και της απόστασης μεταξύ του ηλεκτροδίου γείωσης και της άκρης (L) (Συμπληρωματικά Σχήματα S2 και S3).
(ac) Κατανομή μεγέθους που μετρήθηκε με AFM. (df) Χαρακτηριστικό επιφανειακού φορτίου. (g) Χαρακτηρισμός ROS του EPR.
Είναι επίσης σημαντικό να σημειωθεί ότι για όλες τις παραπάνω συνθήκες, το μετρούμενο ρεύμα ιονισμού ήταν μεταξύ 2 και 6 μA και η τάση μεταξύ -3,8 και -6,5 kV, με αποτέλεσμα κατανάλωση ισχύος μικρότερη από 50 mW για αυτήν την ενιαία μονάδα επαφής EWNS. Παρόλο που το EWNS συντέθηκε υπό υψηλή πίεση, τα επίπεδα όζοντος ήταν πολύ χαμηλά, χωρίς ποτέ να υπερβαίνουν τα 60 ppb.
Το συμπληρωματικό Σχήμα S4 δείχνει τα προσομοιωμένα ηλεκτρικά πεδία για τα σενάρια [-6,5 kV, 4,0 cm] και [-3,8 kV, 0,5 cm], αντίστοιχα. Για τα σενάρια [-6,5 kV, 4,0 cm] και [-3,8 kV, 0,5 cm], οι υπολογισμοί πεδίου είναι 2 × 105 V/m και 4,7 × 105 V/m, αντίστοιχα. Αυτό είναι αναμενόμενο, καθώς στη δεύτερη περίπτωση ο λόγος τάσης-απόστασης είναι πολύ υψηλότερος.
Στο σχήμα 3α,β φαίνεται η διάμετρος του EWNS που μετρήθηκε με το AFM8. Οι υπολογισμένες μέσες διάμετροι του EWNS ήταν 27 nm και 19 nm για τα σχήματα [-6,5 kV, 4,0 cm] και [-3,8 kV, 0,5 cm], αντίστοιχα. Για τα σενάρια [-6,5 kV, 4,0 cm] και [-3,8 kV, 0,5 cm], οι γεωμετρικές τυπικές αποκλίσεις των κατανομών είναι 1,41 και 1,45, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας μια στενή κατανομή μεγέθους. Τόσο το μέσο μέγεθος όσο και η γεωμετρική τυπική απόκλιση είναι πολύ κοντά στο βασικό EWNS, στα 25 nm και 1,41, αντίστοιχα. Στο σχήμα 3γ φαίνεται η κατανομή μεγέθους του βασικού EWNS που μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την ίδια μέθοδο υπό τις ίδιες συνθήκες.
Στο σχήμα 3δ, ε φαίνονται τα αποτελέσματα του χαρακτηρισμού φορτίου. Τα δεδομένα είναι μέσες μετρήσεις 30 ταυτόχρονων μετρήσεων συγκέντρωσης (#/cm3) και ρεύματος (I). Η ανάλυση δείχνει ότι το μέσο φορτίο στο EWNS είναι 22 ± 6 e- και 44 ± 6 e- για [-6,5 kV, 4,0 cm] και [-3,8 kV, 0,5 cm], αντίστοιχα. Έχουν σημαντικά υψηλότερα επιφανειακά φορτία σε σύγκριση με το EWNS βάσης (10 ± 2 e-), δύο φορές μεγαλύτερα από το σενάριο [-6,5 kV, 4,0 cm] και τέσσερις φορές μεγαλύτερα από το σενάριο [-3,8 kV, 0,5 cm]. Το Σχήμα 3στ δείχνει τα δεδομένα φορτίου για το EWNS βάσης.
Από τους χάρτες συγκέντρωσης του αριθμού EWNS (Συμπληρωματικά Σχήματα S5 και S6), φαίνεται ότι το σενάριο [-6,5 kV, 4,0 cm] έχει σημαντικά περισσότερα σωματίδια από το σενάριο [-3,8 kV, 0,5 cm]. Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι η συγκέντρωση του αριθμού EWNS παρακολουθήθηκε έως και 4 ώρες (Συμπληρωματικά Σχήματα S5 και S6), όπου η σταθερότητα παραγωγής EWNS έδειξε τα ίδια επίπεδα συγκέντρωσης αριθμού σωματιδίων και στις δύο περιπτώσεις.
Στο σχήμα 3g φαίνεται το φάσμα EPR μετά την αφαίρεση του βελτιστοποιημένου ελέγχου EWNS (φόντο) στα [-6,5 kV, 4,0 cm]. Τα φάσματα ROS συγκρίθηκαν επίσης με το σενάριο Baseline-EWNS σε μια προηγουμένως δημοσιευμένη εργασία. Ο αριθμός των EWNS που αντιδρούν με παγίδες σπιν υπολογίστηκε σε 7,5 × 104 EWNS/s, ο οποίος είναι παρόμοιος με το προηγουμένως δημοσιευμένο Baseline-EWNS8. Τα φάσματα EPR έδειξαν σαφώς την παρουσία δύο τύπων ROS, με το O2- να είναι το κυρίαρχο είδος και το OH• να είναι λιγότερο άφθονο. Επιπλέον, μια άμεση σύγκριση των εντάσεων κορυφής έδειξε ότι το βελτιστοποιημένο EWNS είχε σημαντικά υψηλότερη περιεκτικότητα σε ROS σε σύγκριση με το EWNS βάσης.
Στο σχήμα 4 φαίνεται η απόδοση εναπόθεσης των EWNS σε EPES. Τα δεδομένα συνοψίζονται επίσης στον Πίνακα Ι και συγκρίνονται με τα αρχικά δεδομένα EWNS. Και για τις δύο περιπτώσεις EUNS, η εναπόθεση είναι κοντά στο 100% ακόμη και σε χαμηλή τάση 3,0 kV. Συνήθως, τα 3,0 kV επαρκούν για 100% εναπόθεση, ανεξάρτητα από την αλλαγή του επιφανειακού φορτίου. Υπό τις ίδιες συνθήκες, η απόδοση εναπόθεσης των Baseline-EWNS ήταν μόνο 56% λόγω του χαμηλότερου φορτίου τους (μέσος όρος 10 ηλεκτρόνια ανά EWNS).
Στο σχήμα 5 και στον πίνακα 2 συνοψίζεται η τιμή απενεργοποίησης των μικροοργανισμών που εμβολιάστηκαν στην επιφάνεια των τοματών μετά από έκθεση σε περίπου 40.000 #/cm3 EWNS για 45 λεπτά στη βέλτιστη λειτουργία [-6,5 kV, 4,0 cm]. Τα εμβολιασμένα E. coli και Lactobacillus innocuous έδειξαν σημαντική μείωση 3,8 logs κατά τη διάρκεια της 45λεπτης έκθεσης. Υπό τις ίδιες συνθήκες, το S. enterica είχε μείωση 2,2 log, ενώ το S. cerevisiae και το M. parafortutum είχαν μείωση 1,0 log.
Οι ηλεκτρονικές μικρογραφίες (Σχήμα 6) απεικονίζουν τις φυσικές αλλαγές που προκαλούνται από το EWNS σε αβλαβή κύτταρα Escherichia coli, Streptococcus και Lactobacillus, οι οποίες οδηγούν στην απενεργοποίησή τους. Τα βακτήρια ελέγχου είχαν άθικτες κυτταρικές μεμβράνες, ενώ τα εκτεθειμένα βακτήρια είχαν κατεστραμμένες εξωτερικές μεμβράνες.
Η ηλεκτρονική μικροσκοπική απεικόνιση των βακτηρίων ελέγχου και των εκτεθειμένων βακτηρίων αποκάλυψε βλάβη στη μεμβράνη.
Τα δεδομένα σχετικά με τις φυσικοχημικές ιδιότητες του βελτιστοποιημένου EWNS δείχνουν συλλογικά ότι οι ιδιότητες (επιφανειακό φορτίο και περιεκτικότητα σε ROS) του EWNS βελτιώθηκαν σημαντικά σε σύγκριση με τα προηγουμένως δημοσιευμένα βασικά δεδομένα του EWNS8,9,10,11. Από την άλλη πλευρά, το μέγεθός τους παρέμεινε στην περιοχή των νανομέτρων, πολύ παρόμοιο με τα αποτελέσματα που αναφέρθηκαν προηγουμένως, επιτρέποντάς τους να παραμένουν στον αέρα για μεγάλα χρονικά διαστήματα. Η παρατηρούμενη πολυδιασπορά μπορεί να εξηγηθεί από τις αλλαγές στο επιφανειακό φορτίο που καθορίζουν το μέγεθος του EWNS, την τυχαιότητα του φαινομένου Rayleigh και την πιθανή συγχώνευση. Ωστόσο, όπως περιγράφεται λεπτομερώς από τους Nielsen et al. 22, το υψηλό επιφανειακό φορτίο μειώνει την εξάτμιση αυξάνοντας αποτελεσματικά την επιφανειακή ενέργεια/τάση της σταγόνας νερού. Στην προηγούμενη δημοσίευσή μας8 αυτή η θεωρία επιβεβαιώθηκε πειραματικά για μικροσταγονίδια 22 και EWNS. Η απώλεια φορτίου κατά τη διάρκεια του χρόνου μπορεί επίσης να επηρεάσει το μέγεθος και να συμβάλει στην παρατηρούμενη κατανομή μεγέθους.
Επιπλέον, το φορτίο ανά δομή είναι περίπου 22-44 e-, ανάλογα με την περίπτωση, το οποίο είναι σημαντικά υψηλότερο σε σύγκριση με το βασικό EWNS, το οποίο έχει μέσο φορτίο 10 ± 2 ηλεκτρόνια ανά δομή. Ωστόσο, πρέπει να σημειωθεί ότι αυτό είναι το μέσο φορτίο του EWNS. Seto et al. Έχει αποδειχθεί ότι το φορτίο είναι ανομοιογενές και ακολουθεί μια λογαριθμική-κανονική κατανομή21. Σε σύγκριση με την προηγούμενη εργασία μας, ο διπλασιασμός του επιφανειακού φορτίου διπλασιάζει την απόδοση εναπόθεσης στο σύστημα EPES σε σχεδόν 100%11.